UCMSC对放射伤树鼩淋巴细胞表达Th1/Th2类细胞因子的干预作用

郭德镔，李青青，王金祥，刘菊芬，王 强，杨建勇，朱向情，潘兴华,杨 嫒

造血微环境和免疫细胞对电离辐射具有高度敏感性，而电离辐射又能催化炎症细胞与炎症因子相互作用，加重造血免疫紊乱，但机制尚未阐明，有研究提示这可能与辅助性T细胞的Th1/Th2的异常或失衡有关[1]。脐带间充质干细胞（UCMSC）具有较强的免疫调节和促进造血重建作用，预计UCMSC对放射性组织损伤及其诱导的炎症、免疫反应可产生治疗效应。有研究证明，在体外T细胞可被PHA、异种抗原、CD3、CD28抗体等刺激活化增殖，而与MSC共培养时，T细胞增殖整体受到抑制，Th1细胞因子分泌减少，Th2细胞因子分泌增加[2]。为探索UCMSC体内移植对淋巴细胞增殖是否有相似的作用，本实验观察了UCMSC治疗对放射伤树鼩外周血和脾淋巴细胞表达Th1/Th2类细胞因子的影响，进而探讨UCMSC调节造血免疫功能的作用机制，为临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 DMEM/F12培养基（Hyclone），胎牛血清、0.25%胰酶（BI）,鼠抗人CD31/CD34/CD44/CD90（4ABiotech），高纯总 RNA 提取试剂盒（BioTeke），荧光定量 PCR-Mix（SYBR Green），PCR 反转录试剂盒（Promega），LifeECO 基因扩增仪(BIOER)，C1000 PCR 仪（BIO-RAD），FACScabilur流式细胞仪（BD 公司），基因引物（GAPDH、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）由昆明硕擎、硕阳公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 UCMSC的复苏、培养、鉴定 UCMSC取自本科室建立的树鼩UCMSC库，参考文献[3]方法复苏细胞。待细胞生长达95%融合后，0.25%胰酶消化， 收集细胞（1×105个/管），PBS洗涤， 分别加入CD31/CD34/CD44/CD90单克隆抗体，流式细胞术分析UCMSC的表型。

1.2.2 实验动物及分组 成年雄性树鼩30只，体重（125.8±9.2）g，由中国科学院昆明动物所提供，生产许可证号：SCXK(滇)K2012-0001。随机分为模型组（15只）、治疗组（15只）。将所有树鼩置于自制的塑料盒内，接受全身一次性4.5 Gy电离辐照，照射剂量及方法参照文献[4]。治疗组于照射后当日开始经股静脉输注UCMSC3×107个/kg），模型组则给予同体积生理盐水，均1次/w，连续治疗4次。实验期间，所有树鼩均普通喂养。

1.3 观察指标 在末次治疗后1 w，分别统计或检测两组下列指标。（1）树鼩存活率；（2）外周血和脾Th1/Th2细胞因子mRNA表达：脱颈处死存活树鼩，参照文献[5]方法,制备脾单细胞悬液，用试剂盒提取RNA。RNA反转录成cDNA。需检测的Th1/Th2细胞因子目的基因（TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）PCR 引物序列见表1。采用实时荧光定量PCR反应，各荧光曲线与基线交叉点的循环数为Ct值。依据公式△Ct=CT目的基因-CTβ-actin与△△Ct=2-△Ct， 计算检测基因的mRNA相对表达量，每组重复3次取平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCMSC的培养和鉴定 复苏后的树鼩UCMSC贴壁生长，大小均一，形态规整，长梭形，呈平行排列或旋涡状生长，低密度时细胞较扁平，高密度时细胞稍细长。流式细胞仪检测UCMSC表面标记CD31/、CD34、CD44、CD90 阳 性 细 胞 率 分 别 约 为:0.2%、0.2%、99.7%、99.8%。

2.2 生存率比较 在照射后4 w，模型组存活率为 53.33%（8/15），治疗组为 86.77%(13/15)，两组比较差异显著（P＜0.05），模型组结果与本课题组前期报道的制备模型相似[4]，表明模型复制成功。

2.3 两组外周血和脾Th1/Th2细胞因子mRNA表达 在连续4次UCMSC治疗后1 w，治疗组外周血和脾 Th1细胞因子（TNF-α、IL-2）均低于模型组（P＜0.05）， 而外周血和脾Th2 细胞因子（IL-4、IL-6）均高于模型组（P＜0.05）。 见表 2、3。

3 讨论

机体的免疫系统对电离辐射具有高度敏感性，即使低剂量的辐射，也能造成免疫失衡。辅助T淋巴细胞是执行免疫防御的重要细胞，主要分为Th1、Th2细胞亚群，正常情况下，两种细胞亚群通过分泌的细胞因子相互制衡。如果受到外界干扰导致Th1/Th2失衡，则会触发异常免疫应答，造成病理状态[6]。Th1、Th2细胞一般通过测量其特定分泌的细胞因子来间接反映二者比例。Th1细胞主要分泌IL-17、TNF、IL-2、IFN-γ，参与细胞免疫；Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-5、IL-10，参与体液免疫。

表1 Th1/Th2细胞因子mRNA引物序列

表2 两组外周血h1/h2细胞因子相对表达量比较

表2 两组外周血h1/h2细胞因子相对表达量比较

注:与治疗组比较,①P＜0.05

Th1细胞因子 Th2细胞因子组别 TNF-α IL-2 IL-6 IL-4治疗组(n=13) 1.00±0.03 1.00±0.09 1.00±0.15 1.00±0.08模型组(n=8) 2.58±0.22 3.98±0.11 0.14±0.01 0.21±0.09

表3 两组脾Th1/Th3细胞因子相对表达量比较

Th1、Th2细胞因子的检测可使用ELASA试剂盒、流式或实时荧光定量PCR等方法检测，但由于树鼩特异性抗体缺乏的限制，最终本实验决定采用实时荧光定量PCR法检测树鼩外周血和脾淋巴细胞分泌的 Th1/Th2 细胞因子 TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4，探讨UCMSC对体内Th1/Th2细胞因子的平衡调节。结果显示，模型组外周血和脾Th1细胞因子（TNF-α、IL-2）均高于治疗组（P＜0.05），提示电离辐射促进TNF-α、IL-2的分泌，Th1/Th2平衡向Th1方向飘移，与文献报道相似[7]。IL-2是T细胞生长因子，能刺激T细胞进人细胞分裂周期，增强T细胞的杀伤活性；TNF-α能刺激纤维母细胞增殖，促进凝血因子和组织因子活性，增强中性粒细胞对血管内皮的粘附性，加速血管出血坏死，还能诱导IL-2的产生。模型组外周血和脾Th2细胞因子（IL-4、IL-6）均低于治疗组（P＜0.05），提示UCMSC移植后促进Th2细胞因子优势化。IL-4可单独维持Th2细胞的增殖，抑制TNF的分泌，还可协同CSF刺激造血细胞的增殖，协同G-CSF增强粒细胞集落形成，协同EPO增强BFU-E的形成，减轻炎症反应，进而维持造血微环境的稳定。IL-6具有复杂的生理功能，它可诱导B细胞分化并产生抗体，促进T细胞增殖，促进骨髓造血干细胞增殖，增强血细胞分化,且不同的刺激对IL-6有不同的主导作用，会导致机体不一样的免疫反应。

综上所述，UCMSC移植治疗放射损伤树鼩，可促进体内外周血和脾中Th1向Th2细胞飘移，结果为细胞治疗放射损伤提供理论依据，但UCMSC对细胞因子的调控机制有待深入研究。

[1] Shimizu Y,Kuwabara H,Ono A,et al.Intracellular Th1/Th2 balance of pulmonary CD4(+)T cells in patients with active interstitial pneumonia evaluated by serum KL-6 [J].Immunopharmacology and Immunotoxicology,2006,28(2):295-304.

[2] Wen S,Dooner M,Cheng Y,et al.Mesenchymal stromal cell derived extracellular vesicles rescue radiation damage to murine marrowhematopoieticcells[J].Leukemia,2016,30(11):2221-2231.

[3] 何洁,赵晶,王金祥,等.冻存脐带间充质干细胞的临床前制备[J].西南国防医药,2016,26(12):1365-1369.

[4] 王强,王永刚,马洪磊,等.树鼩急性放射损伤模型的建立[J].西南国防医药,2016,26(12):1391-1394.

[5] 陈荣伴.急性髓性白血病患者外周血T淋巴细胞亚群及Th1/Th2细胞因子的变化及其临床意义[J].临床和实验医学杂志,2015(16):1356-1358.

[6] Cher DJ,Mosmann TR.Two types of murine helper T cell clone.Ⅱ.delayed-type hypersensitivity is mediated by Th1 clones[J].Journal of Immunology,1987,138(11):3688-3694.

[7] Rödel F,Frey B,Multhoff G,et al.Contribution of the immune system to bystander and non-targeted effects of ionizing radiation[J].Cancer Letters,2015,356(1):105-113.