慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡、心肌纤维化及其相关性研究

魏 玲，李慧萍，魏 伟，刘 茜，尹 娜，甘世保，杨 静，李丽娟，潘兴华

心肌重构是目前公认的慢性心衰的病理生理机制，心肌细胞凋亡及心肌纤维化是其重要的病理基础。本研究探讨了慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡及心肌纤维化的变化及其两者的相互关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立 SPF级健康雄性SD大鼠 20 只，约 3 月龄，体重（300±30）g，由昆明医科大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK（滇）2011-0005]，经过适应性喂养1 w后，随机分成心衰组及正常组。心衰组连续腹腔注射异丙肾上腺素，3 mg/(kg·d)，共14 d，以建立大鼠慢性心衰模型；正常组则同步腹腔注射等体积生理盐水。末次注射后2 w，进行超声心动图检测，以射血分数≦50%为造模成功[1]。

1.2 心肌组织标本的制备 实验结束前一夜，全部大鼠禁食、水，实验结束当天称取大鼠体重后，麻醉大鼠，剪开胸腔，取出心脏，用冰生理盐水洗涤血污，剔除脂肪、血管等非心肌组织后，无菌纱布吸干心脏表面，取左心室部分心肌组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作心肌标本石蜡切片。

1.3 HE染色 心肌标本采用常规HE染色法，切片经苏木素染色后，用伊红液复染，在光学照相显微镜下观察并采图。

1.4 Masson染色 心肌标本石蜡切片常规脱蜡脱水，Weigert铁苏木素染色5 min，自来水洗，用1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟，丽春红酸性品红液染色5 min，蒸馏水快速冲洗，1%磷钼酸水溶液处理5 min，不水洗用苯胺蓝染液复染5 min，1%冰醋酸浸泡1 min，95%酒精多次脱水，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察，采集图像分析。

1.5 TUNEL染色 心肌标本石蜡切片常规脱蜡脱水，用蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，5 min/次。制备TUNEL染色混合液，取Tunel试剂盒内适量 TdT和 dUTP按 2∶29混合，加到圈内覆盖组织，37℃孵育2 h，PBS冲洗3次，5 min/次。切片稍甩干后，每张切片加50 μl converter-POD覆盖组织，37℃孵育30 min。PBS洗涤3次，5 min/次，切片上滴加适量DAB显色液，显微镜下控制显色时间，苏木素复染3 min左右，自来水洗，将切片依次放入75%乙醇6 min、85%乙醇6 min、无水乙醇Ⅰ6 min、无水乙醇Ⅱ6 min、二甲苯Ⅰ5 min脱水透明，中性树胶封片。

1.6 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件分析数据，计数资料用频数和百分率表示，采用χ2检验，两变量相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型建立 根据心脏彩超结果及判定标准（LVEF≤50%），心衰组制备心衰模型均成功。造模后2 w，正常组射血分数为(73.56±5.12)%，显著高于心衰组的(41.32±6.86)%（P＜ 0.01）。

2.2 两组心肌组织结构HE染色比较 HE染色结果显示，心衰组心肌细胞肥大、坏死、心肌纤维化伴炎性细胞浸润，心肌细胞间隙增大伴水肿。而正常组心肌组织心肌纤维排列整齐，细胞形态正常，未见上述病理改变（图1）。

2.3 两组心肌组织结构Masson染色比较 正常组心肌组织纤维排列整齐，仅见少量的胶原纤维增生。心衰组心肌纤维化明显，大量心肌细胞坏死被胶原纤维替代，残留的心肌细胞排列紊乱。心衰组胶原容积比（CVF%）为（55.23±3.55）%，较正常组的（0.32±0.09）%显著增加（P＜ 0.01）。

2.4 两组心肌细胞凋亡比较 正常组心肌细胞凋亡数量很少，而心衰组心肌细胞凋亡率为(44.36±4.17)%，较正常组的 (1.25±0.66)%显著增加（P＜0.01，图 3）。

2.5 心肌胶原容积比与心肌细胞凋亡率的相关性分析 心衰组心肌胶原容积比与心肌细胞凋亡率资料均呈正态分布，Pearson相关分析结果显示，心肌胶原容积比与心肌细胞凋亡呈显著正相关（r=0.893，P＜ 0.01）。

3 讨论

心脏重构是指心脏受到缺血损伤、神经-内分泌系统过度激活、血流动力学改变等慢性刺激后，以心肌细胞肥大、心肌细胞凋亡及心肌纤维化为特征的病理表现，导致心脏外观、大小和功能变化，既是心力衰竭发生发展的决定机制，也是心功能障碍的独立危险因素[1]。心肌细胞死亡包括心肌细胞自噬、坏死及凋亡3种形式，其发生在各种心血管疾病，如心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注的急性及慢性期，其中心肌细胞凋亡即是心肌细胞死亡的主要形式[2]。成人心肌细胞属于终末分化细胞，当心肌组织遭受缺血、缺氧、氧化应激及压力超负荷时，结果会诱导心肌细胞受损伤，心肌细胞凋亡，心肌细胞数量减少和心肌纤维化[3]。

图1 两组心肌组织结构HE染色比较（400×）

图2 两组心肌组织结构Masson染色比较(400×)

图3 两组心肌细胞凋亡比较(400×，TUNEL染色)

心肌细胞凋亡是代偿性心肌重构转向心力衰竭的关键环节，是心脏功能进行性恶化及最终死亡的重要基础[4]。纽约心脏病协会报道，心功能Ⅲ、Ⅳ的心衰患者的心肌凋亡比占心肌组织的0.12%～0.70%，而正常心肌组织只占0.001%～0.01%[5]。Van等[6]研究发现,如果某心肌组织中的心肌细胞凋亡率＞0.1%时，该心肌组织每年会有近37%的心肌细胞死亡。研究报道，自发性高血压大鼠发生心肌肥厚及心肌细胞凋亡时，其心肌细胞凋亡数是正常组的4倍[7]。心肌纤维化是心功能障碍、心脏骤停及心律失常的独立预测因素，也是心脏重构的一大病理特征[8]。根据有无心肌细胞坏死及心肌瘢痕组织形成，心肌纤维化分为反应性纤维化及修复性纤维化。反应性纤维化又分为间质纤维化及血管周围纤维化，其不出现心肌细胞坏死及瘢痕的形成；修复性纤维化心肌组织将出现心肌细胞坏死及瘢痕组织。心肌纤维化导致心脏僵硬度增加、顺应性降低，心脏传导阻滞，心脏收缩及舒张功能障碍，最终导致心力衰竭的发生[9]。

本实验结果显示，心衰组心肌纤维化较正常组显著增加，存在心肌细胞广泛坏死、心肌纤维断裂溶解、心肌间质胶原纤维过度沉积，大片状瘢痕组织增生，心肌组织结构紊乱，且心肌细胞凋亡率也显著升高，提示慢性心衰大鼠存在心肌细胞凋亡率与心肌纤维化，且二者之间的变化呈显著正相关。

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