BMSC移植治疗对慢性心衰大鼠心肌结构与功能的影响

王 欢，朱向情，刘 茜，熊云兰，朱姿英，卢国良，潘兴华，魏 玲

有研究显示，骨髓间充质干细胞（BMSC）移植可以抑制心肌梗死后心肌纤维化，改善心功能[1-2]。但移植的BMSC是否对慢性心衰心肌纤维具有抑制作用，目前尚无定论。本研究利用慢性心衰大鼠模型，观察了BMSC对慢性心衰大鼠心肌纤维化、心肌细胞凋亡及心肌胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA表达水平的调节作用，探讨BMSC对大鼠慢性心衰进程及心肌重构的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DMEM-F12培养基（HyClone公司），胎牛血清（BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司），慢病毒载体LV-EGFP（上海吉凯生物有限公司），大鼠成骨诱导完全培养基、SD大鼠成脂诱导完全培养基（广州赛业生物科技有限公司），盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司)，Masson染色试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司），TUNEL试剂盒（Roche公司）。

1.2 BMSC的制备 取6只1月龄SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌取大鼠股骨、胫骨骨髓，接种于T75细胞培养瓶中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，48 h后首次全量换液，以后每2～3 d换液1次。当细胞贴壁达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3进行传代。按试剂盒操作指南进行BMSC成骨、成脂诱导分化鉴定。取第3代的BMSC重悬后计数，铺板于48孔板中，细胞数为5×105个/孔，以按感染复数（MOI）150计算并加入慢病毒LV-EGFP，病毒转染滴度为1.8×1010U/ml，继续培养、观察BMSC生长及GFP表达情况。

1.3 慢性心衰大鼠模型建立及BMSC移植 SPF级雄性 SD 大鼠 30 只，3 月龄，体重（300±30）g，由昆明医科大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK（滇）2011-0005]，随机分为移植组、模型组和正常对照组，每组10只。移植组和模型组大鼠连续腹腔注射异丙肾上腺素，3 mg/(kg·d)，共 14 d，经超声心动图测定，左心室射血分数（LVEF）＜50%。移植组大鼠于尾静脉注射 EGFP 标记的 BMSC（5×106个/ml，1 ml/只），模型组同步注入同体积生理盐水，对照不做处理。各组大鼠在造模后2 w及BMSC移植4 w后，用探头频率为12 MHz的彩色多普勒超声心动仪（Philip公司，美国）检测LVEF。实验结束后称取各组大鼠体重后，麻醉大鼠，取心脏称重并计算心重/体重指数。

1.4 各组心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA的表达检测 采用荧光定量PCR法，用RNAiso Plus试剂盒提取总 RNA， 取 2 μg总 RNA，用GoScriptTMReverse Transcription System Kit制备cDNA并置于-20℃冰箱保存。采用荧光定量PCR仪扩增CollagenⅠ和CollagenⅢ，CollagenⅠPCR引物：上游 5'AGAGGCATAAAGGGTCATCGTG3'，下游5'CAGGTTGCAGCCTTGGTTAGG3'。 CollagenⅢPCR引物：上游5'GTCGGAGGAATGGG TGGCT AT3'，下游 5'CATTGCGTCCATCAAA GCCTC3'。内参 GAPDH引物：上游 5'TTCCTACCCCCAATG TATCCG3'，下游5'CATGAGGTCCACCACCCTGTT3'。PCR结束后获取 Ct值并计算 2-△△Ct，分析表达差异。

1.5 心肌病理组织学观察 取心脏称重后的大鼠心肌组织，常规石蜡包埋、切片，层厚5 μm，进HE染色、Massons染色及Tunel染色。另取心肌组织，采用OCT法包埋并进行冰冻切片（15 μm），于倒置荧光显微镜下观察植入BMSC的存活及分布情况并采图。

1.6 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，重指数用单因素方差分析，多个样本均数间两两比较采用LSD检验，两变量相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC制备及GFP基因标记结果 大鼠BMSC原代培养48 h后，可见少量细胞贴壁，成短小梭形或三角形（图1A）。贴壁生长后体积增大，多呈梭形，培养10～14 d左右，融合度达80%～90%（图1B）。传代后的BMSC呈均一放射状排列，成纤维样细胞外观（图1C）。BMSC成骨诱导21 d后，可见明显的茜素红染色阳性钙结节（图1D）。成脂诱导14 d后，细胞内可见油红O染色阳性脂滴（图1E)。加入LV-EGF培养4 d后，EGFP表达率达90%(图1F）。

2.2 BMSC在心脏中的定植 注射EGFP标记的BMSC的大鼠的心肌组织经冰冻切片后，在荧光显微镜下观察，可见心肌组织出现表达EGFP的绿色荧光细胞（图2A、2B），模型组及正常对照组则未见绿色荧光细胞（图 2C、2D）。

2.3 各组心功能、心重/体重指数及行为学观察模型组、移植组 HW/BW 分别为（6.01±0.30）%、（5.33±0.23）%，均明显高于正常组（4.12±0.25）%（P＜ 0.01），但BMSC移植组低于模型组（P＜0.01）。模型组LVEF 为（33.66±2.51）%，低于正常组的（75.67±4.04）%（P＜0.01）。BMSC移植治疗4 w后，移植组LVEF为（44.0±3.6）%，高于模型组（P＜ 0.01）。正常组大鼠未见死亡，表现为活泼好动，饮水、摄食正常，体重增加；心衰组大鼠出现体重减轻、摄食饮水减少、呼吸急促、心率增快、精神萎靡等；BMSC移植后，活动能力增强、摄食饮水增加、精神状态改善、体重增加、呼吸及心率减慢。

图1 BMSC生长形态及EGFP基因标记结果

2.4 心肌组织病理变化 HE染色显示，模型组（图3C）、移植组（图3B）可见心肌细胞肥大及凋亡、心肌纤维排列紊乱、心肌间质炎性细胞浸润伴纤维瘢痕组织增生，而正常组（图3C）未见上述病理改变。BMSC治疗4 w后，移植组心肌纤维化、心肌细胞肥大及重构程度较模型组轻。模型组（图3F）胶原容积分数为55.60±3.65，心肌组织间质内可见大量的胶原纤维，无心肌细胞再生。移植组（图3E）心肌间质中胶原纤维明显减少，心肌细胞在瘢痕组织中少量再生，胶原容积分数为35.71±4.88，低于模型组（P＜0.01）。而正常组心肌纤维排列整齐，心肌纤维化少见，胶原容积分数仅为0.31±0.09（图3D）。正常组大鼠（图3G）心肌细胞凋亡率为（1.53±0.69）%。模型组大鼠 （图3I）心肌组织心肌细胞凋亡率为（43.61±4.88）%，高于正常组（P＜ 0.01）。 移植组（图3H） 凋亡率为 （23.55±3.62）%， 低于模型组 （P＜0.01）。

2.5 各组心肌CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达水平比较 正常组、移植组、模型组心肌CollagenⅠ基因的mRNA相对表达量分别为0.03±0.01、0.52±0.31、2.12±0.98，CollagenⅢ基因的 mRNA 相对表达量分别为 0.08±0.05、0.80±0.45、2.69±2.38。模型组心肌CollagenⅠ和CollagenⅢ的mRNA表达水平高于正常组及移植组（P＜0.05），而正常组与移植组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图 4。

3 讨论

图2 EGFP标记BMSC在心肌内的分布

图3 各组大鼠心肌组织病理染色结果

注：与正常组、移植组比较，①P＜0.05

心肌纤维化是心肌修复的主要病理表现，可以导致心脏僵硬度增加，心脏顺应性降低，心脏传导阻滞，心肌收缩及舒张功能障碍，最终导致心力衰竭的发生[2-3]。MSC移植后可在心肌缺血微环境下分化为心肌细胞，分泌促细胞及血管生成因子，抑制心肌细胞凋亡，增加心肌灌注，减少心肌细胞外基质沉积，改善心肌重构，提高心功能[4-5]，但其机制目前尚不明了。

本研究采用BMSC移植治疗慢性心衰大鼠4 w后，大鼠心肌Collagen I和CollagenⅢ mRNA的表达量明显减少，提示BMSC移植后显著抑制心肌纤维化的作用，这可能是抑制心肌纤维化的机制之一。超声心动图结果显示,BMSC治疗后4 w,大鼠心脏LEVF有显著增加，收缩功能明显改善，心功能改善，而模型对照大鼠的收缩功能进一步下降。病理组织学检测显示,BMSC治疗后4 w，大鼠心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡率明显降低，心肌细胞数量增加，心肌间质胶原沉积减少。这些结果表明，BMSC治疗能明显改善心衰大鼠心衰症状，使大鼠心重/体重指数减小，呼吸及心率减慢，体重增加。

综上所述，BMSC移植治疗可改善慢性心衰大鼠心肌重构，使心肌细胞凋亡减少，瘢痕组织形成减少，间质胶原沉积减轻，这可能是其抑制心肌纤维化的机制之一。

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