锌指样转录因子4与动脉粥样硬化研究进展

罗彩云 丁家望 郑霞霞 周 天 张再强

(三峡大学第一临床医学院心内科，湖北 宜昌 443003)

动脉粥样硬化(AS)是引起心血管事件的病理基础，其发病机制尚不明确。目前更倾向于认为AS是一种慢性血管炎症性疾病〔1〕，血管壁在各种内源性及外界刺激下损伤，多种炎症因子、免疫细胞及相关细胞因子相互作用发挥炎性效应，形成慢性炎症。近来发现，锌指样转录因子(KLF)4是参与调控心血管系统的重要转录因子〔2〕，能通过不同途径抑制或激活炎性因子，调控血管内皮细胞活化、巨噬细胞极化、平滑肌细胞(SMC)增殖和迁移，发挥心血管保护作用。本文探讨KLF4在AS的作用。

1 KLF4的概述

KLFs家族属于真核生物中含锌指结构较保守的转录因子家族，是生物体内一类具有重要功能的蛋白质，参与细胞生长、增殖、分化及凋亡等多个生命活动的调控〔2〕。KLF4是KLFs家族中的一员，在机体多种组织及细胞表达，如血管内皮、SMC、巨噬细胞等。KLF4基因定位于9q31，其cDNA编码全长为1 413 bp，编码由470个氨基酸组成的蛋白质。KLF4具有3个不同功能的结构域，包括DNA结合结构域、转录调节结构域和核定位序列，是其发挥生物学效应的基础。DNA结合结构域位于羧基末端，主要识别并结合与其具有高度亲和力的富含GC的DNA序列〔3〕，这是KLF家族其中一个显著的特点。KLF4氨基端含有转录调节结构域，包括两个不同位点的转录激活结构域和转录抑制结构域，表明 KLF4具有激活基因转录和抑制基因转录双重效应。由于非DNA结合区域高度变异，KLF4能与不同靶基因结合发挥不同的生物学效应。KLF4在细胞周期或细胞凋亡中发挥作用，主要是通过抑制P53的表达参与调节细胞周期中的G1/S期和G2/M期〔4〕。

2 KLF4与AS炎症细胞的相互作用

KLF4是AS斑块浸润的SMC、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等细胞中的重要转录因子，在不同细胞中发挥着不同的作用，从基因水平上调控靶基因将为防治AS提高到新水平。

2.1KLF4与SMC表型转化 血管SMC(VSMCs)的表型转化是高血压、AS和血管再狭窄等血管重塑性疾病的主要病理学基础〔5〕。正常VSMC呈收缩表型，KLF4低表达，但是，当氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、免疫损伤等AS危险因素存在时，SMC向合成型转化，KLF4表达水平明显升高〔6〕，这表明KLF4表达水平的高低与SMC表型有关。Shankman等〔7〕研究发现，条件性敲除SMC KLF4基因可抑制SMC表型转化及增强斑块稳定性，免疫沉淀技术检测到SMC有多个KLF4靶点，而这些靶点可能参与吞噬、凋亡、细胞迁移及炎症等多个过程，抑制或促进AS发生发展。由此推断，VSMC表型的转化受到KLF4信号网络的调控。

Myocardin是血清反应因子(SRF)的转录激活因子，通过调控 CArG-盒依赖性基因，参与SMC分化的关键环节〔8〕。Turner等〔9〕研究发现，Myocardin启动子内的上游阻遏区域(URR)有3个进化保守的KLF4位点，在特定条件下阻遏KLF4与启动子结合，持续促进Myocardin基因表达。相反，当KLF4过表达显著降低Myocardin mRNA水平，抑制Myocardin对SMC分化标记基因的激活作用。然而，KLF家族中的KLF5或KLF2并不具备这种功能。这表明，KLF4在调控SMC分化标志基因方面可能具有特异性。还有研究发现，KLF4是一个直接受过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ蛋白调控的下游靶因，PPARγ拮抗剂通过激活Akt蛋白激酶信号及抑制KLF4去泛素化来维持KLF4蛋白的稳定表达，从而影响VSMCs增殖分化〔10〕。

表观遗传调控是判定SMC分化状态的一个重要调节方式，尤其是在SMC分化标志基因启动子区域组蛋白乙酰化修饰的调控。SMC染色质结构受到多种因素的影响，转化生长因子(TGF)-β1是一个强效促 VSMC 分化因子，TGF-β1 通过介导p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和smad信号通路促进磷酸化KLF4与P300结合及组蛋白H3乙酰化，从而促进SMC标志基因的转录〔11，12〕。而视黄酸活化KLF4与TGF-β1 有着类似的作用方式〔13〕。促SMC增殖刺激因子血小板源性生长因子(PDGF)-BB诱导KLF4去磷酸化和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)2去乙酰化，两者与细胞外信号调节激酶(ELK)1协同作用抑制SMC标志基因的表达〔14〕，这表明，促使组蛋白乙酰化的因素都与诱导KLF4 表达有关，可以推断，染色质重塑的过程依赖于KLF4。SMC α-actin标志基因组蛋白H4乙酰化，被发现是HDAC2和HDAC5与KLF4直接交互作用产生〔15〕。这一结果进一步说明，KLF4 是通过组蛋白乙酰化修饰抑制SMC分化标志基因。研究KLF4与组蛋白乙酰化之间的关系，从表观遗传学角度揭示VSMC表型调节机制及分化的新机制。

MicroRNAs代表控制SMC分化状态的另一种表观遗传机制，通过针对性降解信使RNA发挥转录后抑制作用。miR-1与KLF4直接结合调控胚胎干细胞向SMC分化〔16〕。KLF4是TGF-β和骨形态发生蛋白(BMP)4诱导SMC收缩基因表达的先决条件，TGF-β和BMP4通过诱导miRs-143 和miRs-145迅速下调KLF4表达〔17〕。此外，KLF4介导miR-15a阻止细胞周期进程，减少内皮细胞和VSMC细胞周期蛋白D1表达〔18〕。综上所述，转录因子 KLF4对维持VSMC内环境的平衡是必不可少的。

2.2KLF4与巨噬细胞 内皮下的巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源。巨噬细胞不同亚型极化及其作用是近年来AS病理研究的热点，巨噬细胞主要分为经典活化的巨噬细胞M1和替代性活化的巨噬细胞M2两个亚型。Sharma等〔19〕发现，巨噬细胞极化依赖于转录因子KLF4的调控。骨髓细胞或巨噬细胞KLF4缺失的APOE-/-小鼠较APOE-/-小鼠血脂明显升高，IL-6和IL-1β促炎因子表达水平升高，AS斑块面积增加。提示KLF4促进巨噬细胞向M2型分化，负向调控免疫应答。这表明，KLF4具有抑制血管炎症和抗AS的作用。Karpurapu等〔20〕研究者运用非增殖性PU.1诱导的髓系祖细胞和分化的骨髓巨噬细胞模型，发现PU.1能够特异性与去甲基化的KLF4启动子结合，巨噬细胞分化标志F4/80表达增强。相反，敲除胞嘧啶核苷脱氨酶(AICDA)基因可抑制KLF4启动子去甲基化，PU.1与KLF4亲和力明显下降。结果表明，KLF4启动子通过去甲基化修饰调控巨噬细胞的活化，可能是通过胞嘧啶核苷脱氨酶发挥作用。

巨噬细胞是促进斑块不稳定的重要炎症细胞，微环境的变化会影响巨噬细胞活化。干扰素(IFN)-γ、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)-α下调KLF4表达，诱导巨噬细胞活化，降低斑块稳定性，而抗炎因子TGF-β1作用则相反〔21〕。然而，KLF4与TGF-β1相互作用的分子机制尚不清楚。Feinberg等〔21〕研究发现，KLF4与核因子(NF)-κB家族P65共同作用于诱导型一氧化氮合酶(iNOS)启动子，通过拮抗信号蛋白Smad3羧基端激活剂p300/CBP 抑制TGF-β1/Smad3信号通路。由此证明，KLF4在调控促炎症反应巨噬细胞发挥重要作用，同时可以作为调控 TGF-β1/Smad3信号通路的靶点。此外，其他研究从促进脂质代谢方面阐述了KLF4在巨噬细胞中的意义。 Stavri等〔22〕发现，单核细胞向巨噬细胞分化时，高表达的KLF4与CAMP反应元件结合蛋白(CREB)协同激活载脂蛋白(APO)E基因启动子，抑制斑块的进展并减少并发症的发生。提示以KLF4为靶点调控巨噬细胞APOE基因表达，改善脂质代谢内环境，将为抗AS治疗提供更有效的方式。

2.3KLF4与血管内皮细胞 KLF4表达于血管内皮细胞的细胞质和胞核，在调节血管生物学功能中起重要作用。缺失KLF4的内皮细胞或造血细胞可上调黏附分子的表达，促使AS斑块巨噬细胞聚集，浸润的炎性细胞以旁分泌的方式促进SMC增殖，诱导损伤的新生内膜形成〔23〕。KLF4高表达可下调TNF-α诱导的血管细胞黏附分子(VCAM)1的表达，并能抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血栓调节蛋白(TM)的表达并能减少促炎细胞因子产生，具有抗炎、抗血栓作用〔24〕。研究发现，运用siRNA技术沉默 KLF4基因的小鼠较控制组血管内皮钙黏蛋白的表达减弱，内皮细胞通透性增强，小鼠更易出现肝损伤、肺水肿〔25〕。结果表明，KLF4具有维持内皮细胞屏障功能的作用。他汀类药物上调内皮细胞抗AS基因与KLF家族转录因子相关〔26〕。为明确基因调控的机制，研究者对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)给予他汀类药物处理后进行微阵列分析，发现KLF4是高度诱导基因，靶点则是位于其近端启动子区域的肌细胞增强因子(MEF)2。由此可见，KLF4将是他汀类药物调节内皮细胞的一个新的转录因子。

NF-κB是调控炎症、凋亡、自噬过程的中枢，选择性抑制SMC NF-κB信号通路，能减弱SMC表型转化和新生内膜形成。并且，NF-κB与KLF4同时参与内皮细胞表达黏附因子、巨噬细胞迁移的调控，但是两者之间的作用方式具有细胞选择性，如在SMC中两者具有协同作用，而在内皮细胞和巨噬细胞相互拮抗〔27〕。

2.4KLF4与淋巴细胞 TH17是新近发现的一种CD4+细胞亚型，在炎症性疾病、自身免疫性疾病扮演重要作用。初始CD4+细胞向其他T细胞亚型分化受到特异性转录因子调控。研究者〔28〕发现，KLF4能与TH17 细胞启动子结合，表明KLF4能直接调控TH17细胞分化。并且，在敲除KLF4基因小鼠体内发现，调控TH7细胞的重要转录因子维甲酸相关孤核受体(ROR)yt表达上调，这表明KLF4与RORyt两种转录因子在调节TH17细胞分化方面分别发挥作用。

3 展 望

AS是多种细胞及细胞因子参与的慢性血管炎症性疾病，其中斑块的形成是AS的标志。如何减缓斑块的形成和破裂，减少并发症的发生仍是目前最大的难题。大量研究表明，KLF4具有调节SMC增殖和分化、抑制巨噬细胞发挥炎症效应、维持内皮细胞的正常功能等多种生物学效应，从而减轻炎症和增强斑块稳定性，以KLF4为靶点将会为治疗AS带来新的曙光。但是，KLF4调控AS斑块浸润的不同细胞的分子机制及是否能诱导SMC向其他细胞表型定向转化等一系列问题仍需大量的研究验证。

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