黄芪多糖通过抑制NF-κB和JNK信号通路减轻LPS诱导的小鼠心肌细胞凋亡

韩 琳，王洪新，鲁美丽

(锦州医科大学心脑血管药物研究重点实验室，辽宁 锦州 121001)

心肌细胞凋亡是指心肌细胞程序性自主死亡。近年研究发现，氧化应激、缺血/再灌损伤等可诱导细胞凋亡[1-2]，在各种心血管疾病的发病机制和预后中发挥重要作用。所以，抗心肌细胞凋亡对心脏疾病的治疗是一个重要的靶点。促分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)通路是真核细胞调控介导细胞内信号转导的重要系统，参与动物细胞的增殖、凋亡、分化、转化等生物学反应，包括ERK、JNK、p38 MAPK 以及 ERK5/BMK1四条途径[3]。通常情况下，ERK起保护细胞作用，而JNK和p38 MAPK则表现为促凋亡作用[4]。当JNK被不同的刺激因子激活后，其转移至细胞核内，激活其下游作用底物——核内转录因子(c-Jun)，并磷酸化。研究发现，c-Jun大量磷酸化可导致细胞凋亡和分化[5]。ASK1-MKK4/7-JNK信号通路可以激活细胞氧化应激通路，调控NF-κB的活性，使一氧化氮(NO)的生成增加，诱导细胞损伤[6]。NF-κB是核转录因子，通过调节炎症因子、诱导酶、趋化因子等，在免疫、炎症、凋亡中发挥重要作用[7]。NF-κB既可调节其下游的促炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达,又可被其反馈激活，进而放大炎症反应，上调NF-κB的表达，诱导细胞凋亡[8]。

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黄芪的主要活性成分之一，研究发现，APS具有免疫促进剂或调节剂及增强机体抵抗力的作用，尤其具有保护心肌的作用[9]。现已证实，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)能刺激NF-κB和JNK信号通路的活化[10]，且本实验室前期实验已证明APS可抑制心肌细胞凋亡[11]，但其具体机制尚不明确。本研究采用LPS诱导小鼠心肌细胞凋亡，通过检测相关凋亡因子表达水平及其在心肌组织中的浸润情况，阐明APS通过抑制NF-κB和JNK信号通路减轻LPS诱导的小鼠心肌细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1药品与试剂黄芪多糖，南京景竹生物技术有限公司，批号JZ150206A，APS纯度为98%；LPS，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；IL-β、TNF-α ELISA试剂盒购自R&D公司；一抗p-JNK、JNK、IκB-α、Bcl-2、caspase-3、β-actin均购自ABclonal公司；Bax抗体购自Proteintech公司；HRP山羊抗兔IgG(H+L)、NF-κB购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL化学发光显色试剂盒、BCA试剂盒、细胞质细胞核蛋白提取试剂盒、FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均购自美国 Sigma公司；高糖DMEM培养基购自Gibco公司；小牛血清购自美国 Hyclone公司。

1.2实验动物与细胞♂ SPF级昆明小鼠40只，7周龄，体质量(20±2)g，由锦州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK2014-0004。H9c2细胞株购自武汉博士德生物有限公司。

1.3仪器DMI 3000B 倒置显微镜(德国Leica公司)；凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、转印机(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(上海赛默飞世尔仪器有限公司)；小动物超声影像系统Prospect3.0(台湾S-Sharp公司)；超净工作台(江苏吴县市净化技术研究所)；CO2孵箱(美国Sheldon Manufacturing Inc公司)。

1.4方法

1.4.1动物实验分组 SPF级昆明小鼠40只，随机分为空白对照组、模型组、APS(200、400、800 mg·kg-1)组，每组8只，对照组和模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃。14 d后，给药组和模型组腹腔注射LPS(10 mg·kg-1)，8 h后进行下一步实验。

1.4.2H9c2心肌细胞的培养 用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液，于37℃、5% CO2恒温培养箱中进行常规培养。至密度90%左右时传代，以2×107·L-1浓度接种6孔板，约48 h后换液1%胎牛血清16 h，进行诱导分化后开始实验。实验所需药品APS为水溶性，以三蒸水溶解后，用0.22 μm针式滤器过滤除菌；APS预先孵育30 min后，加入1 mg·L-1LPS，24 h后进行各指标的测定。实验共分为5组：空白对照组、LPS模型组(1 mg·L-1)、APS低、中、高剂量组(10、25、50 mg·L-1)。

1.4.3超声心动检测心脏情况 对照组和模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃。14 d后，给药组和模型组腹腔注射脂多糖10 mg·kg-1，8 h后，小鼠吸入麻醉，超声心动测左心室射血分数(ejection fraction,EF)、左心室缩短分数(fractional shortening,FS)、搏出量(stroke volume,SV)、心输出量(cardiac output，CO)。

1.4.4ELISA法检测IL-1β、TNF-α水平 小鼠摘眼球取血于EP管中，常温下静置2 h，析出血清后，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。根据试剂盒说明书操作，酶标495 nm波长处测定吸光度(OD)值。

1.4.5TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 取心肌组织常规固定，冰冻切片，用PBS冲洗30 min，甩干后3%过氧化氢-甲醇处理10 min，PBS浸洗3次，每次5 min，然后在冰上进行如下操作：0.1% Triton X-100、0.1%柠檬酸钠溶液处理2 min，PBS浸洗2次，每次5 min，TUNEL反应混合液37℃孵育1 h，PBS浸洗3次。吸净PBS，用荧光显微镜进行观察。

1.4.6细胞核细胞质蛋白的提取 将心肌组织碾碎成细小碎片，按照20 ∶1的比例混合细胞质蛋白抽提试剂A和B，加入PMSF配制成终浓度为1 mmol·L-1的混合液，每60 mg的组织中加入200 μL匀质液，冰浴放置15 min，15 000 r·min-1离心5 min，把上清移至EP管中，此为细胞质蛋白。每20 μL的细胞沉淀再加入200 μL细胞质蛋白抽提试剂A，超声10 s,冰浴15 min，加入细胞质蛋白抽提试剂B，超声10 s,冰浴1 min，再超声10 s,4℃、15 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，此为细胞质蛋白。然后将沉淀加入细胞核蛋白抽提剂，最高涡速30 s,冰浴2 min，再次涡速30 s，共30 min，然后4℃、15 000 r·min-1离心10 min,取上清液，此为细胞核蛋白。贴壁细胞用细胞刮子刮下并用移液器吹打，离心收集，然后实验方法与上述相同。

Tab 1 Effects of APS on LPS-induced hemodynamics in mice(±s,n=8)

EF: Left ventricular ejection fraction; FS: Left ventricular shortening score; SV: Stroke volume; CO: Cardiac output.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

1.4.7Western blot检测 取冷冻心肌组织100 mg和心肌细胞悬液200 μL，加入1 mL蛋白裂解液，用超声细胞破碎仪于冰上超声，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，将离心后的上清BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。10%的BSA室温封闭2 h后，分别加IκB-α(1 ∶1 000)、NF-κB (1 ∶500)、p-JNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶5 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、 Lamin-B(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶5 000)一抗，孵育过夜。然后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1 ∶5 000)，室温孵育l.5 h，ECL发光剂显色发光，生物发光成像分析仪检测分析。

2 结果

2.1APS对小鼠心功能的影响超声心动图结果显示，不同浓度的APS能有效地防止LPS引起的心肌功能的减退，其作用存在剂量依赖性。如Tab 1所示，与正常组相比，模型组的EF和FS都明显降低，模型组心肌收缩功能明显改变(P<0.01)；与模型组相比，APS(400、800 mg·kg-1)处理组EF和FS明显恢复(P<0.01)。

2.2APS对血清TNF-α、IL-1β水平的影响TNF-α、IL-1β是促炎症因子，它们可以被LPS诱导，并激活NF-κB和JNK信号通路，进而引起心肌细胞凋亡。Tab 2的ELISA结果表明，LPS诱导后TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.01)，APS (400、800 mg·kg-1)能有效抑制LPS刺激后TNF-α、IL-1β水平的升高，其作用呈剂量依赖性(P<0.01)。

2.3APS对心肌细胞凋亡的影响如Fig 1所示，与正常对照组相比，LPS组细胞凋亡明显增加(P<0.01)。与LPS组相比，APS (400、800 mg·kg-1)干预后能明显降低凋亡(P<0.01)，而APS 200 mg·kg-1组的凋亡率与LPS组比较无差别。

Fig 1 Effect of APS on cardiomyocyte apoptosis(×200)

Tab 2 Effects of APS on contents of TNF-α and

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

2.4APS对LPS诱导的JNK通路的影响APS是否通过JNK信号通路而抑制心肌细胞凋亡呢？在体内与体外实验中，与正常对照组相比，LPS组p-JNK明显升高(P<0.01)；与LPS组相比，APS中、高剂量组p-JNK明显降低(P<0.01)，且呈剂量依赖性，而JNK则没有明显变化(Fig 2)。

2.5APS对LPS诱导的NF-κB信号通路的影响Fig 3 Western blot结果表明，在体内与体外实验中，LPS处理后细胞质中的IκB-α、NF-κB蛋白表达降低(P<0.01)，而细胞核中NF-κB的表达增高(P<0.01)； APS中、高剂量可明显抑制IκB-α降解和NF-κB向核内转移(P<0.05)。提示APS对LPS诱导的IκB-α的降解和NF-κB向核内转移有抑制作用。

2.6APS对Bcl-2、caspase家族的影响Fig 4结果显示，与对照组相比，模型组Bax、caspase-3蛋白表达明显增高，而Bcl-2表达降低(P<0.01)；APS中、高剂量组中Bax、caspase-3的蛋白表达明显降低，Bcl-2表达增高(P<0.01)。提示APS对caspase家族、Bax蛋白表达有抑制作用，而促进Bcl-2蛋白表达。

3 讨论

心肌细胞凋亡与许多心血管疾病的发生、发展有关联。Bcl-2特异性抑制细胞凋亡的主要机制是其在线粒体水平上与Bid、Bim或Bad结合,却与Bax或Bak解离,从而维护线粒体膜的完整性,因而防止膜间隙中凋亡蛋白的渗出;同时还可以抑制Ca2+的释放,降低线粒体对Ca2+的摄取,从而抑制心肌细胞凋亡。另外,Bcl-2还能直接与凋亡蛋白活性因子-1(Apaf-1)结合,形成Bcl-2/ Apaf-1/caspase-9复合物,也能阻断caspase的始动激活[12]。caspase-3是caspase家族在心肌细胞凋亡过程中重要的蛋白酶、多种凋亡途径的共同下游效应因子、心肌细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，可直接诱导细胞凋亡。本研究中，LPS模型组心肌组织中Bcl-2降低, Bax、caspase-3的蛋白表达增加。而APS中、高剂量组均可增加Bcl-2表达，降低Bax、caspase-3的蛋白表达。表明APS可以对抗LPS诱导的心肌细胞凋亡，对心脏起保护作用。

Fig 2 Effect of APS on LPS-induced JNK pathway in vivo and in vitro(±s,n=8)

A: The protein levels of JNK and p-JNK were measured by Western blotinvivoexperiments; B: The protein levels of JNK and p-JNK were measured by Western blotinvitroexperiments.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

Fig 3 Effect of APS on LPS-induced NF-κB signaling pathway in vivo and in vitro(±s,n=8 )

The contents of IκB-α and NF-κB protein in cytoplasm of cardiomyocyte induced by LPS-induced myocardiuminvivo(A) andinvitro(B); APS inhibited the content of NF-κB protein in LPS-induced nuclearinvivo(C) andinvitro(D).**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS model.

既往研究显示，NF-κB和JNK信号通路可以诱导心肌细胞凋亡[13-14]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPKs家族成员，在细胞凋亡中也是重要的信号通路,当其受到外界刺激后，JNKK1/MKK4/SEK1或者JNKK2/MKK7介导JNK上Thr183和Tyr185位点磷酸化，使JNK完全活化并具有酶催化活性[7]。而当JNK被活化后，其转移到细胞核内，并使它主要的下游作用物c-Jun磷酸化，激活依赖于转录的凋亡信号通路[15]。p-JNK诱导心肌细胞凋亡可能的机制是既可促进多种凋亡蛋白的表达,又可通过线粒体水平发挥其有效抗凋亡作用,还可作用于Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak等，诱导细胞色素释放入细胞质内,从而激活细胞凋亡的起始[12]。本实验体内、体外研究中，APS中、高剂量组可以明显降低JNK蛋白的磷酸化，表明APS对抗LPS诱导的心肌细胞凋亡可能与JNK信号通路有关。

Fig 4 Effects of APS on Bcl-2 and caspase

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

NF-κB是一个转录因子，在炎症、凋亡等细胞生理活动中发挥重要作用。NF-κB的活化可被炎症因子IL-1β、TNF-α激活，进而引起一系列的心肌损伤。NF-κB既可以调节IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放，又可以被其反馈调节。IκB是一个分子复合物，当IκB被激活磷酸化后，NF-κB p65/50异源二聚体从复合物IκB中脱落，并从细胞质进入细胞核，诱导细胞凋亡。我们研究发现，APS中、高剂量组可以有效抑制LPS诱导的IκB磷酸化和随后的降解，而且阻止NF-κB p65/50进入细胞核，并使其下游细胞因子IL-1β、TNF-α释放减少。所以我们推断，APS可能通过抑制信号通路NF-κB来抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡。

综上所述，LPS通过活化NF-κB和JNK信号通路诱导心肌细胞凋亡，APS减少LPS所致心肌细胞凋亡的机制可能与抑制NF-κB和JNK信号通路有关。本实验部分揭示了APS的作用机制，并且为心血管疾病的治疗提供了新的靶点，为寻找新的治疗药物提供了新的思路。

(致谢: 本实验完成于锦州医科大学心脑血管药物研究重点实验室，实验过程中得到该实验室全体老师的指导及同学的协助，在此表示感谢。)

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