HPLC同时测定三七不同部位4种皂苷含量

唐卿雁 陈庚 卢迎春 张广辉 赵艳 张宪民 杨生超

摘 要 建立同时测定三七地上和地下部分人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc含量的高效液相色谱方法。采用Agilent Zorbax EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长203 nm，柱温40℃。结果表明：人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc分別在0.062～18.479、0.060～17.870、0.063～18.556、0.064～19.169 μg，呈良好线性关系（r>0.999 95）；三七中4种皂苷的平均回收率（n=6）分别为99.53%、100.56%、99.90%、99.60%，RSD分别为0.54%、0.60%、0.49%、0.55%。在三七地上部分和地下部分各组织中，人参皂苷Rb1在芦头部位的含量最高，人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc和三七皂苷Fc的含量均在叶片中最高。该方法简便、准确，分离效果好，适用于三七人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的测定。

关键词 三七 ；高效液相色谱法 ；皂苷含量

中图分类号 R917 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.018

Abstract The high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for simultaneous determination of ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc and notoginsenoside Fc in different parts of Panax notoginseng. The Agilent Zorbax EC-C18 （4.6 mm×100 mm， 2.7 μm） column was used in the HPLC， the mobile phases were acetonitrile-0.2% phosphoric acid with gradient elution， the detection wavelength was 203 nm， the flow rate was 1.0mL/min， and the column temperature was 40℃. The results showed that ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc and notoginsenoside Fc had good linearity relationship （r>0.999 95） in the range of 0.061 6～18.479， 0.060～17.870， 0.063～18.556 and 0.064～19.169 μg， respectively. The ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc， and notoginsenoside Fc had average recoveries （n=6） of 99. 53%， 100.56%， 99.90 % and 99.60%， and their relative standard deviations were 0.54%， 0.60%， 0.49% and 0.55%， respectively. The results showed that the saponins content in the underground parts and aerial parts were different apparently. The content of ginsenoside Rb1 was the highest in the rhizome， while the contents of ginsenosides Rb3 and Rc， and notoginsenoside Fc were the highest in the leaves. This HPLC method was simple and accurate with better separation effect， and hence was suitable for determination of ginsenosides Rb1， Rb3， Rc and notoginsenoside Fc.

Keywords Panax notoginseng ； high performance liquid chromatography ； saponins content

三七[Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen]是五加科人参属多年生草本植物，又名山漆、金不换、血参、田山七等[1]。有近600年的使用历史和400年的栽培历史[2]，其最适栽培区主要分布在我国云南、广西等地[3]。三七具有散瘀止血、消肿定痛、防止脑缺血、降脂和保护肝脏等功效[4-5]，与人参共享“北参南七”的美称。人们的传统习惯多以三七的根及根茎入药， 现已开发以三七为主要原料的药品、保健品、化妆品达数百种，如云南白药、复方丹参滴丸、血塞通、片仔癀等[6]。人参皂苷是三七的主要活性物质，目前已从三七的不同部位分离得到70余种单体皂苷[7-8]。人参皂苷按照其苷元结构可划分为3类，即达玛烷型、齐墩果烷型和奥克梯隆型。达玛烷型人参皂苷按照苷元上连接的羟基不同又可分为原人参二醇型和原人参三醇型[9]。三七所含的人参皂苷主要为原人参二醇及原人参三醇型皂苷[10]。目前的研究主要集中在三七地下部分的单体皂苷物质，而一些稀有皂苷，尤其是对三七地上部分皂苷的研究相对较少。三七地上部分和地下部分单体皂苷的种类和含量差别较大，因此有必要探讨一种方法能同时对其进行检测。本试验利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）对三七地上和地下部分均含有的4种单体皂苷含量进行测定和分析，为进一步合理利用三七，尤其是对三七地上部分进行综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

试验材料采集于云南省文山州砚山县，经云南农业大学杨生超教授鉴定为三七。选取15株长势良好、完整的3年生三七植株，按不同部位分开，分为须根、主根、芦头、果、茎、果梗、叶片。将三七各部位样品放入105℃烘箱中烘20 min后，将温度降至85～86℃烘至恒重，取出，置干燥器中冷却至室温，用粉碎机粉碎后过65目筛备用。参照中国药典2015年版一部[11]中三七含量测定方法，略做改动。取各样品粉末0.6 g，精密称定，加入50 mL甲醇，称量，超声（100 W，50 kHz）处理30 min，冷却，再称量，用甲醇补足损失的量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.1.2 仪器和试剂

Agilent 1260系列高效液相色谱仪（G1311C四元泵，G1329B 自动进样仪，G1316A 柱温箱，G1315D二极管阵列检测器）和Agilent ChemStation 工作站，梅特勒托利多AE240 型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），微型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司），NB-5200 型超声波仪（郑州南北仪器设备有限公司）。

人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201122，纯度95%）由中国药品生物制品检定所提供，人参皂苷Rc对照品（批号：MUST-17030322，纯度99.65%）和人参皂苷Rb3对照品（批号：MUST-17030212，纯度99.65%）由中科院成都生物研究所提供，三七皂苷 Fc对照品（批号：15061204，纯度99.80%）由成都普瑞科技开发有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，24% A，10～40 min，24～36% A，40～50min，36%～100% A），流速1 mL/min，检测波长203 nm，柱温40℃，进样量为10 μL。

1.2.2 线性关系考察

分别精确称取人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc标准品6.35、6.38、6.52、6.35 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，摇匀，制得单一标准品溶液。分别精密量取标准品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，以色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg） 为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。

人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc标准品的高效液相色谱图如图1。

1.2.3 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，按1.2.1项下色谱条件连续进样6次，求得人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的峰面积的相对标准偏差RSD分别为0.2%、0.1%、0.3%、0.2%，表明仪器精密度良好。

1.2.4 重复性试验

分别精密称取三七主根部位粉末0.5 g，平行称定6份，按1.1项下方法操作，制备供试品溶液6份，按1.2.1项下色谱条件，测定人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc，以人参皂苷 Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc标准样品为对照峰，相对峰面积的RSD分别为0.5%、0.5%、0.2%、0.4%，表明该方法有较好的重复性。

1.2.5 稳定性试验

三七主根部位待测供试品溶液按1.2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、6、12、24 h分别进样测定。结果显示，人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的RSD分别为0.6%、0.4%、0.3%、0.5%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

1.2.6 回收率试验

精密量取已知含量的三七主根部位粉末约0.25 g，加入1.2.2制备的标准样液各5 mL，按1.1 方法制备供试溶液，按1.2.1色谱条件测定峰面积并计算回收率。结果人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc平均回收率（n=6）分别为99.53%、100.56%、99.90%、99.60%，RSD分别为0. 54%、0.60%、0.49%、0.55%。

1.2.7 样品含量测定

取1.1的供试品溶液，依1.2.1項条件进样测定，利用外标法计算人参皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的含量，并通过SPSS 19.0 软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 三七地下部分各组织的皂苷含量分析

对三七地下不同部位4种皂苷含量进行测定分析，结果见表2。

三七地下部分的人参皂苷Rb1含量最高，其中芦头部位的Rb1含量显著高于主根和须根。主根中未检测到人参皂苷Rb3和三七皂苷Fc，而芦头与须根中人参皂苷Rb3含量较低，且差异不显著。芦头与须根之间比较，三七皂苷Fc含量芦头高于须根，两者差异显著。人参皂苷Rc在芦头部位的含量高于主根，而须根略高于主根。对4种皂苷的总量进行比较可知，在三七的地下部分中，芦头的皂苷总量最高，其次是主根和须根。

2.2 三七地上部分各组织的皂苷含量分析

三七地上部分各组织的皂苷含量测定结果如表3。由表3可以看出，叶片、茎、果、果梗各部位的皂苷含量差异较大。

对地上部分不同部位的人参皂苷Rb1含量分析可知，它在叶片中含量较高，其次为果梗、茎和果，但各部位Rb1含量差异不显著。茎的人参皂苷Rb3含量较低，其他3个部位人参皂苷Rb3含量大小顺序依次为叶片、果梗和果，叶片与果梗之间的人参皂苷Rb3含量差异显著，而茎与果之间的人参皂苷Rb3含量差异不显著。叶片中人参皂苷Rc含量最高，果梗次之，果和茎的较低。叶片与果梗之间的人参皂苷Rc含量差异显著，果与茎之间的人参皂苷Rc含量差异不显著。三七地上各个部位三七皂苷Fc含量比较可知，叶片的最高，其次是果梗、果和茎。叶片与果梗之间的三七皂苷Fc含量差异显著，果与茎之间的差异不显著。对三七地上部分四种皂苷的总量进行比较可知，叶片的皂苷总量远高于其他几个部位，其次是果梗和果，茎中的皂苷总量最低。

3 讨论与结论

3.1 讨论

对三七地上和地下部分的4种皂苷含量进行比较分析可知，地上部分的总皂苷含量比地下部分的高，而地下部分芦头中人参皂苷Rb1的含量最高。三七的地下部分已经被广泛地用于药物的研发，地上部分则利用率较低。三七地上部分除富含丰富的皂苷外，还含有黄酮类、氨基酸类、挥发油、微量元素等有用成分[12]，具有较高的开发潜力。

三七的皂苷含量与其生长的年限、种植环境等有较大关系，因此不同年限和不同产地的三七各部位皂苷种类及含量还有待深入比较分析。由于本试验只测定了4种在三七地上和地下部分都存在的主要皂苷，而三七具有极高的药用价值，源于其含有多种具有生理活性的皂苷。因此，还有很多类型的皂苷有必要去进一步测定。同时，三七皂苷积累的分子机理，可通过利用转录组、代谢组和蛋白组等生物技术手段进行深入研究[13-15]。

3.2 结论

本研究测定了3年生三七不同部位的4种皂苷，即人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc和三七皂苷Fc的含量，结果表明三七地下部分人参皂苷Rb1的含量最高，其中芦头是人参皂苷Rb1主要积累的部位。地上部分的叶片中人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc和三七皂苷Fc含量显著高于其他部位，说明人参皂苷Rb3、Rc主要在叶片部位积累。

本试验建立了同时检测三七地上和地下部分人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc和三七皂苷Fc的方法。该方法条件简单，分离效果好，重现性高，可为三七的质量评价以及合理开发利用提供依据。

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