竹节参总皂苷通过调节AMPK/Sirt1/NF—κB通路抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡的作用研究

宋亚男+袁丁+张长城+王烙佩+何毓敏+王婷+周志勇

[摘要] 研究竹節参总皂苷（saponins extracted from Panax japonicus，SPJ）对自然衰老大鼠心肌细胞凋亡的调节作用及其作用机制。将SD雄性大鼠随机分为青年对照组、自然衰老组、SPJ低剂量组、SPJ高剂量组，每组10只。自然衰老组、SPJ低、高剂量组从18月龄开始分别灌胃给予生理盐水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1，每周灌胃6 d，持续6个月至24月龄处理动物。HE染色观察各组大鼠心肌形态；Tunel法检测心肌细胞凋亡；Western blot检测各组大鼠心肌组织中Bcl-2，Bax，IL-1β，TNF-α，AMPK，p-AMPK，Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表达。SPJ能有效改善自然衰老大鼠心肌纤维的排列紊乱，减少炎性细胞浸润，抑制心肌细胞凋亡。同时，SPJ能明显抑制自然衰老过程中心脏组织Bax，IL-1β，TNF-α，Ac-NF-κB p65的表达，促进Bcl-2，Bcl-2/Bax，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白表达。SPJ可有效抑制自然衰老大鼠心肌细胞凋亡，其作用机制可能与调节AMPK/Sirt1/NF-κB通路介导的炎症反应有关。

[关键词] 竹节参总皂苷； 自然衰老大鼠； 心肌细胞凋亡； 炎症反应； AMPK/Sirt1/NF-κB信号通路

[Abstract] To investigate the effects of saponins extracted from Panax japonicus（SPJ） on cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats and explore its underlying mechanisms. SD male rats were randomly divided into four groups： young control group， natural aging group， SPJ low dose group and SPJ high dose group， with 10 rats in each group. The rats in natural aging group， SPJ low and high dose groups were respectively treated with normal saline， SPJ 10 and 60 mg·kg-1·d-1 from the beginning of 18 month-old， 6 days per week for 6 months till 24 month-old. Then the animals were sacrificed. Their myocardial morphology changes were observed by using haematoxylin-eoin（HE） staining； cardiomyocyte apoptosis was tested by using Tunel assays； and the protein expression levels of Bcl-2， Bax， IL-1β， TNF-α， AMPK， p-AMPK， Sirt1， and Ac-NF-κB p65 in myocardial tissues of rats were detected by Western blot. The results showed that SPJ could effectively improve the arrangement disorder of myocardial fibers， reduce the infiltration of inflammatory cells and inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats. At the same time， SPJ could significantly inhibit the protein expression of Bax， IL-1β， TNF-α and Ac-NF-κB p65， and increase the expression of Bcl-2， Bcl-2/Bax， p-AMPK/AMPK and Sirt1 in the heart tissues of natural aging rats. SPJ can effectively inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats， and its mechanisms may be related with the regulation of inflammatory reaction by AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway.

[Key words] saponins extracted from Panax japonicus； natural aging rats； cardiomyocyte apoptosis； inflammatory response； AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway

随着我国人口老龄化的不断推进，心血管疾病的发病、死亡率逐年上升。衰老是导致心血管疾病发生、发展的重要危险因素[1]，在正常衰老过程中，心肌细胞凋亡数量显著增多[2]，心脏表现出慢性低度炎性状态[3]；随着衰老的加剧心肌细胞凋亡和炎症反应不断增加，最终导致心脏重构和心功能衰退。竹节参系五加科人参属植物竹节参Panax japonicus的干燥根茎，是我国西南地区民间常用中草药，竹节参总皂苷（saponins extracted from P.japonicus，SPJ）为其主要活性成分。研究表明SPJ能抑制H9c2大鼠心肌细胞中促凋亡蛋白Bax的活性，降低Caspase-3的表达，促进抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌细胞凋亡[4]；同时能降低心肌梗死大鼠血清中MCP-1，TNF-α水平，抑制心肌细胞炎症反应，改善心脏功能[5]。但SPJ对自然衰老大鼠心脏组织的保护作用尚未见报道。本研究将利用自然衰老大鼠模型，从心肌细胞凋亡和心肌炎症方面探讨SPJ对自然衰老大鼠心脏组织的保护作用及其机制，为临床应用提供理论基础和实验依据。endprint

1 材料

1.1 動物 SPF级SD雄性大鼠，18月龄30只，6月龄10只，均购自三峡大学实验动物中心，实验单位使用许可证号SYXK（鄂）2011-0061，许可证号SCXK（鄂）2011-0012。

1.2 仪器 IX53显微镜（日本Olympus公司）；LEICA EG 1150H石蜡包埋机、LEICA TP 1020自动脱水机、LEICA EG 1150C超薄切片机（德国Leica公司）；PowerPacTMBasic电泳仪（美国Bio-Rad公司）；BioshineChemiQ 4800化学发光凝胶成像自动显影仪（中国上海欧翔科学仪器有限公司）。

1.3 药物与试剂 竹节参的块根采集于湖北恩施椿木营竹节参种植基地，由日本国立富山大学博士，现就任三峡大学医学院讲师何毓敏鉴定为五加科人参属植物竹节参P.japonicus的干燥根茎。SPJ的提取方法见本课题组前期工作，提取率为18.4%，纯度83.48%[6]。苏木精（G1004）、伊红（G1001）、PMSF（G2008）、磷酸蛋白酶抑制剂（G2007）、ECL显影液（G2014）均购自武汉谷歌生物科技有限公司；RIPA裂解液（C1053）、BCA蛋白浓度定量试剂盒（P1511）均购自北京普利莱基因技术有限公司。Tunel-细胞凋亡原位检测试剂盒（德国Roche公司，10768100）。AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-25792）；p-AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-33524）；TNF-α（Santa Cruze，sc-1350）；Ac-NF-κB p65（Abcam，ab19870）；IL-1β（Abcam，ab9722）；Bcl-2（Abcam，ab59348）；Bax（Abcam，ab182733）；Sirt1（Millpore，07-131）；GAPDH（Cell Signaling，5174）。辣根过氧化酶标记的山羊抗兔（125510）、山羊抗小鼠（125435）、兔抗山羊（111004）均购自武汉科瑞生物技术有限公司。

2 方法

2.1 分组及给药 将30只18月龄SD雄性大鼠随机分为自然衰老组、SPJ低剂量组、SPJ高剂量组，每组10只，从18月龄开始分别灌胃给予生理盐水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1；每周灌胃6 d；持续6个月至24月龄处理动物；另取10只6月龄大鼠做青年对照组。

2.2 HE染色观察SPJ对衰老大鼠心肌组织形态变化的影响 大鼠腹腔注射给予20%乌拉坦5～7 mL·kg-1麻醉后，快速取出心脏组织，组织块经4%中性多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制作切片其厚度为4 μm。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯入水后，苏木精染核，盐酸乙醇分化，伊红染色，再经乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树脂封片，光学显微镜下观察心肌组织的形态变化。

2.3 Tunel试剂盒检测SPJ对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响 石蜡切片经常规脱蜡脱苯入水处理后，按照Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒的操作步骤染色，光镜观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕褐色。于400倍的光镜下每张切片随机选择2～3个视野，计算每个视野中凋亡细胞核数和总细胞核数，计算心肌细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。

2.4 Western blot检测SPJ对衰老大鼠心肌组织蛋白表达的影响 称取约50 mg的心脏组织，加入700 μL裂解液（按RIPA裂解液-PMSF-磷酸蛋白酶抑制剂A，B液=100∶1∶1配制）研磨、离心，提取得到总蛋白。BCA法蛋白定量，加入2×的上样缓冲液煮沸变性10～15 min，SDS-PAGE 凝胶电泳并转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次（5 min/次），二抗室温孵育1 h后，TBST洗3次（5 min/次），加入ECL显影液显色。化学发光凝胶成像系统下显影成像，ImageJ1.42q软件对目的条带进行灰度扫描，目的蛋白表达水平以其与内参GAPDH 灰度比值来表示。

2.5 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理，Western blot结果采用ImageJ1.42q软件进行分析，数据以±s表示，用单因素方差分析检验各组间差异的显著性，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 SPJ对衰老大鼠心肌组织形态变化的影响 HE结果显示，6月龄大鼠心肌纤维排列整齐，结构清晰、紧凑，未见炎性细胞浸润；与6月龄大鼠相比较，24月龄大鼠心肌纤维排列紊乱、疏松，细胞间隙增大，同时出现大量炎性细胞浸润。SPJ低、高剂量能明显改善衰老大鼠心脏组织的肌纤维形态及其病理性变化，见图1。

3.2 SPJ对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响 Tunel法的原理是细胞凋亡过程中基因组DNA发生断裂，脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）可催化标记这些DNA链断裂和缺口处的3′-OH末端，进行后续识别，将正常细胞核染成蓝色，凋亡阳性细胞核染成棕褐色。结果显示，6月龄大鼠仅见个别凋亡细胞，24月龄大鼠细胞凋亡数显著增加；而SPJ干预后心肌细胞凋亡数量明显减少，见图2。统计结果表明，与6月龄大鼠相比较，24月龄大鼠的心肌凋亡指数显著升高（P<0.01）；与24月龄大鼠比较，SPJ低、高剂量组大鼠的凋亡指数明显降低（P<0.01）。

3.3 SPJ对衰老大鼠心肌凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax表达水平的影响 与6月龄大鼠相比，24月龄大鼠心脏组织中Bcl-2蛋白含量显著下降（P<0.01），Bax蛋白表达量上升（P<0.05），且Bcl-2/Bax明显降低（P<0.05）。而给予低、高剂量的SPJ后，与24月龄大鼠相比较，Bcl-2蛋白表达量和Bcl-2/Bax均有所上升，尤其是SPJ高剂量组大鼠更加明显（P<0.01）；Bax蛋白表达呈下降趋势，且SPJ高剂量大鼠显著降低（P<0.01），见图3。endprint

3.4 SPJ對衰老大鼠心肌组织中炎性因子IL-1β，TNF-α的影响 与6月龄大鼠相比，24月龄大鼠心脏中炎性因子IL-1β，TNF-α的表达水平显著上调（P<0.05）。给予低、高剂量的SPJ干预后，与24月龄大鼠相比，IL-1β，TNF-α的蛋白含量均有所下降，且以SPJ高剂量组效果最佳（P<0.01）；此外，SPJ低剂量组的炎症因子TNF-α表达也显著降低（P<0.05），见图4。

3.5 SPJ对衰老大鼠心肌组织中AMPK活化、Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表达的影响 与6月龄大鼠比较，24月龄大鼠心肌组织中AMPK活化，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白水平明显下调、Ac-NF-κB p65蛋白表达上调。给予低、高剂量的SPJ与24月龄大鼠相比较，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白的表达显著升高，而Ac-NF-κB p65蛋白的表达显著下降，并具有明显的统计学差异，见图5。

4 讨论

中医学认为心为五脏六腑之大主，主血脉；气乃构成和维持人体生命活动的物质基础。心气可推动、调节血液在脉管中的运动并流注全身，发挥营养和滋润的作用。年老体虚者中气不足，“心气亏虚，无力温运血脉，血行不畅，停而为瘀”[7]。《中国药典》2015年版指出：竹节参具散瘀止血、消肿止痛、滋补强壮之功效，主要用于跌扑损伤、病后虚弱等症状[8]。现代药理学研究表明机体衰老过程中心脏僵硬度增加、顺应性降低、舒缩功能障碍，并伴随着 心肌细胞凋亡增加，心肌炎性反应加剧，最终导致心脏重构和心功能衰退，进一步诱发多种继发病[9-10]；而竹节参的主要成分竹节参总皂苷具有抗炎[11]、抗肿瘤[12]等多种药理活性，对心血管系统具有良好的药理作用。

基于此，本实验将以自然衰老大鼠为模型，研究竹节参总皂苷对心肌细胞凋亡的保护作用及其作用机制。HE结果显示，SPJ可明显改善大鼠衰老进程中所伴随的心肌纤维疏松、紊乱，心肌细胞肿胀、间隙增大以及大量的炎性细胞浸润等病理现象，表明SPJ对自然衰老大鼠的心脏组织具有良好的保护作用。

心肌细胞凋亡是心脏衰老的重要特征，有研究指出，在D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型中，抗凋亡蛋白Bcl-2表达上升，促凋亡蛋白Bax表达下降，心肌细胞凋亡明显增加[13]。Tunel和Western blot结果显示：SPJ能有效干预大鼠在自然衰老过程中所表现的心肌细胞凋亡数、细胞凋亡指数显著增加，促凋亡蛋白Bax的表达水平上调，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达以及Bcl-2/Bax显著下降。说明SPJ能显著抑制自然衰老大鼠的心肌细胞凋亡。

炎症反应是心脏衰老的主要特征，衰老可促使心肌炎症反应增强，导致心功能受损[14]；激活炎性因子如TNF-α，IL-1β能诱导心肌细胞凋亡，促使心肌细胞减少、心脏组织功能障碍[15] 。本课题组前期工作证明，SPJ能显著抑制脂多糖刺激下RAW264.7巨噬细胞所分泌的炎性因子TNF-α，IL-1β，从而达到抗炎目的[11]。本实验结果也显示，SPJ能有效抑制自然衰老大鼠心脏组织中炎性因子TNF-α，IL-1β的表达，抑制炎症反应。说明大鼠心脏组织在衰老过程中炎症反应增加，其分泌的大量炎性因子是诱导心肌细胞凋亡的重要因素；而SPJ能显著抑制炎症反应及其诱导的心肌细胞凋亡，从而保护衰老大鼠心脏组织。基于此，本实验将进一步深入探讨SPJ对抗衰老大鼠炎性反应的作用机制。

NF-κB是调节炎症反应的关键蛋白；生理条件下，胞浆中NF-κB与抑制蛋白IκB结合处于失活状态；当细胞受到刺激时，NF-κB活化，其主要亚基NF-κB p65与IκB解离并转移到胞核激活转录，调控下游多种炎症相关因子，促进炎症反应[16]。有研究表明，沉默信息调节因子1 （silent information regulator 1，Sirt1）可将NF-κB p65去乙酰化阻止NF-κB p65信号通路活化，降低多种促炎细胞因子的表达[17-18]。而激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acti-vatedprotein kinase，AMPK）可上调巨噬细胞中Sirt1 的表达水平，降低NF-κB乙酰化和促炎因子的表达；并进一步指出，AMPK对NF-κB的抑制作用需要Sirt1的参与[19-20]。同时，本实验结果显示，SPJ能有效促进衰老大鼠心脏中AMPK活化及Sirt1蛋白表达，抑制Ac-NF-κB p65蛋白表达。由此说明SPJ抑制自然衰老大鼠炎症反应的作用机制与AMPK/Sirt1/NF-κB信号通路有关。

综上所述，SPJ对自然衰老大鼠心脏组织具有良好的保护作用。其机制可能是SPJ通过促进衰老大鼠心脏组织中AMPK蛋白磷酸化，上调Sirt1蛋白表达水平，抑制NF-κB p65乙酰化，下调其下游相关炎性因子的表达，从而抑制炎症反应，降低心肌细胞凋亡。故推测，SPJ抑制自然衰老大鼠心肌细胞凋亡的作用机制可能与AMPK/Sirt1/NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。

[参考文献]

[1] Lakatta E G. So！ What′s aging？ Is cardiovascular aging a disease？[J]. J Mol Cell Cardiol， 2015， 83：1.

[2] Liu M， Zhang P， Chen M， et al. Aging might increase myocardial ischemia / reperfusion-induced apoptosis in humans and rats[J]. AGE， 2012， 34（3）：621.

[3] Xia S， Zhang X， Zheng S， et al. An update on inflamm-aging： mechanisms， prevention， and treatment[J]. J Immunol Res， 2016， 2016（1）：1.endprint

[4] 徐媛青. 竹节参总皂苷对急性心肌梗死大鼠的保护作用及机制研究[D]. 宜昌：三峡大学， 2012.

[5] Wei N， Zhang C， He H， et al. Protective effect of saponins extract from Panax japonicus on myocardial infarction： involvement of NF-κB， Sirt1 and mitogen-activated protein kinase signalling pathways and inhibition of inflammation[J].J Pharm Pharmacol， 2014， 66（11）： 1641.

[6] 贺海波，徐媛青，魏娜，等.竹节参总皂苷对H2O2致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（17）：187.

[7] 刘莉，刘丽丽，隋艳波，等.从气虚论治心力衰竭[J]. 中医药信息， 2014，31（6）：39.

[8] 中国药典.一部[S]. 2015.

[9] Quarles E K， Dai D F， Tocchi A， et al. Qualitycontrol systems in cardiac aging[J]. Ageing Res Rev， 2015， 23： 101.

[10] Costantino S， Paneni F， Cosentino F. Ageing， metabolism and cardiovascular disease[J]. J Physiol， 2016， 594（8）：2061.

[11] 代艳文，袁丁，万静枝，等.竹节参总皂苷通过NF-κB通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用研究[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（11）：2076.

[12] 袁丁，左锐，张长城.竹节参总皂苷对人白血病细胞株HL-60的作用[J].结合医学学报， 2007， 5（5）：570.

[13] Li M， Ouyang W， Wu X， et al. Kinetin inhibits apoptosis of aging spleen cells induced by D-galactose in rats[J]. J Veter Sci， 2014， 15（3）：353.

[14] Machi J F， Dias D D S， Freitas S C， et al. Impact of aging on cardiac function in a female rat model of menopause： role of autonomic control， inflammation， and oxidative stress[J]. Clin Interv Aging， 2016， 11（Issue 1）：341.

[15] Henrich D， Seebach C， Wilhelm K， et al. High dosage of simvastatin reduces TNF-alpha-induced apoptosis of endothelial progenitor cells but fails to prevent apoptosis induced by IL-1beta in vitro[J]. J Surg Res， 2007， 142（1）：13.

[16] Forman K， Vara E， García C， et al. Influence of aging and growth hormone on different members of the NF-κB family and IκB expression on heart from a murine model of senescence-accelerated aging[J]. Exp Gerontol， 2015， 73：114.

[17] El A M， Angulo J， Rodríguez-Maas L. Oxidative stress and vascular inflammation in aging[J]. Free Rad Biol Med， 2013， 65（6）：380.

[18] Stein S， Matter C M. Protective roles of SIRT1 in atherosclerosis[J]. Cell Cycle， 2011， 10（4）：640.

[19] Yang Zhenggang， Barbara B Kahn， Hang Shi，et al. Macrophage α1 AMPactivated protein kinase （α1AMPK） antagonizes fatty acid-induced inflammation through SIRT1[J]. J Biol Chem， 2010， 285（25）：19051.

[20] 宋亞男，王佼，袁丁，等. Sirt1在心血管衰老中的作用机制研究进展[J]. 中国医院药学杂志，2017，37（17）：1767.

[责任编辑 张宁宁]endprint