高效液相色谱法同时测定大黄中14种成分的含量

刘月红+黄政海+董玲+裴纹萱+孙裕+高晓燕

[摘要] 建立高效液相色谱法同时测定大黄中大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚、番泻苷A、番泻苷B、没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-4′-羟基苯基-2-丁酮、莲花掌苷、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷14个成分含量的方法。采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），采用0.05%的磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温40 ℃，检测波长268 nm。结果表明在线性范围内14个成分线性良好（r>0.999 9）；日内精密度和日间精密度均小于3.1%；平均回收率在91.80%～104.1%。同时，对收集到的10个掌叶大黄和10个唐古特大黄合格样品进行定量测定，发现掌叶大黄中含量比较高的成分是芦荟大黄素，唐古特大黄中含量比较高的是4-4′-羟基苯基-2-丁酮，各样品中所有化合物的含量差异都比较大。所建立的含量测定方法能同时测定大黄中14个成分的含量，为大黄药材多成分含量测定和质量控制提供一种简便的方法。

[关键词] 大黄； 高效液相色谱法； 蒽醌类； 苯丁酮苷类； 鞣质类； 含量测定

[Abstract] To establish an HPLC （high performance liquid chromatography） method for the simultaneous content determination of gallic acid， （+）-catechin， （-）-epicatechin-3-O-gallate， isolindleyin， 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone， emodin， chrysophanol， physcion， aloe-emodin， rhein， lindleyin， 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone-4′-O-β-D-（2″-O-galloyl-6″-O-cinnamoyl）-glucopyranoside， sennoside A and sennoside B in Rhei Radix et Rhizoma. The analysis was performed on Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） with 0.05% phosphoric acid solution （A） - acetonitrile （B） as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1 mL·min-1， with column temperature of 40 ℃ and the wavelength was set at 268 nm. All calibration curves showed good linearity （r > 0.999 9） within the concentration range. Both the intra- and inter-day precision for 14 analytes was less than 3.1%， with the mean recovery at the range of 91.80%-104.1%. Meanwhile， quantitative determination was carried out for 10 qualified samples from Rheum palmatum and 10 qualified samples from R. tanguticum. respectively. It was found that the content of 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone and aloe-emodin were higher in the R. tanguticum and R. palmatum， respectively， and the content of all the compounds was different in each sample. The established HPLC method for simultaneous content determination of 14 compounds from Rhei Radix et Rhizoma could be used for quantitative assessment and quality control of Rhei Radix et Rhizoma.

[Key words] Rhei Radix et Rhizoma； HPLC； anthraquinones； butanone glycosides； tannins； content determination

大黄为蓼科植物掌叶大黄 Rheum palmatum L.、唐古特大黄 R. tanguticum Maxim. ex Balf. 或药用大黄R. officinale Baill.的干燥根和根茎[1]。目前，对于大黄的化学成分和药理作用都比较清楚。从大黄属植物中已分离得到160多种化合物[2]，按照化学结构可分为蒽醌衍生物、二苯乙烯苷、苯丁酮苷、鞣质、有机酸等。药理研究表明大黄具有泻火[3]、利胆[4]、保肝[5]、抗菌[5]、抗炎[6]及抗癌[7]等药理作用，据报道蒽醌及其苷类是泻下作用的主要活性成分，其中番泻苷活性最强[8]。2015年版《中国药典》规定大黄含大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚5种蒽醌的总量不得少于1.5%[1]，而其泻下的主要活性成分番泻苷的量未做要求，此外，虽然大黄中多成分的含量测定方法已有报道，主要方法有薄层色谱法[9]、高效液相色谱-紫外检测法[10]、高效液相色谱-质谱法[11]、高效毛细管电泳法[12]、毛细管电泳色谱法[13-18]，但是关于苯丁酮苷类化合物的含量测定未见报道。因此，本实验建立了一种同时测定大黄中蒽醌类、苯丁酮苷類以及鞣质类共14个化合物的含量测定方法，为大黄质量控制水平的提高提供方法学依据。endprint

1 材料

电子分析天平 （BP211D，ALC-210.4，CPA225D） 为德国Sartorius公司产品；超声波清洗器 （D-78224） 为德国ELMA公司产品；旋转蒸发仪 （N-1000旋转蒸发仪，SB-1000数字水浴锅及CA-1111循环冷凝水系统） 为日本EYELA公司产品；Agilent 1100液相色谱仪 （Four-unit pump，Auto-sampler，DAD detector，Chemstation workstation） 为美国Agilent公司产品。

分析纯甲醇和磷酸为北京化工厂产品，色谱纯甲醇和乙腈为默克公司产品 （Merk，Darmstadt，Germany），去离子水经Milli-Q系统纯化。

没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-4′-羟基苯基-2-丁酮、莲花掌苷、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、大黄素和大黄酚9种对照品为本实验室分离得到（经HPLC归一化法检测，纯度大于98%），大黄酸（批号0757-200206）、芦荟大黄素（批号110795-200605）和大黄素甲醚（批号110758-200610）3种对照品购自中国食品药品检定研究院，番泻苷A（批号1126070-15204229）、番泻苷B（批号1165756-20905097）购自美国Fluka公司。

掌叶大黄和唐古特大黄药材均经北京大学中医药现代研究中心屠鹏飞教授分别鉴定为蓼科植物掌叶大黄R. palmatum和唐古特大黄R. tanguticum的干燥根及根茎。本实验采用2015年版药典大黄含量测定方法，对所采集到的36批掌叶大黄样品、39批唐古特大黄样品进行了含量测定，从2种大黄中分别筛选出10批合格样品，见表1，进行以上14个指标成分的定量，以期确定合格大黄中这些指标成分的含量范围。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm × 150 mm，5 μm），预柱为Agilent Zorbax Extend C18 （4.6 mm×10 mm，5 μm）。进样量10 μL，检测波长268 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温40 ℃，流动相0.05%的磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，2%～10% B； 5～13 min，10%～15% B； 13～26 min，15%～17% B； 26～38 min，17%～22% B； 38～54 min，22%～36%B； 54～60 min，36%～60% B； 60～80 min，60% B）。

2.2 对照品溶液的配制 分别称取没食子酸0.34 mg、儿茶素0.65 mg、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯11.8 mg、异莲花掌苷8.4 mg、4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮6.10 mg、莲花掌苷2.95 mg、番泻苷B 2.54 mg、番泻苷A 1.86 mg、芦荟大黄素1.05 mg、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷0.77 mg、大黄酸0.79 mg、大黄素0.77 mg、大黄酚0.88 mg、大黄素甲醚0.76 mg，分别置于5 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，储存于4 ℃的冰箱中，作为对照品贮备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 将干燥的大黄药材粉碎，过100目筛，精密称取本品粉末1 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声提取1 h，放冷，用70%甲醇补足失重，摇匀，过滤（0.22 μm），取续滤液作为供试品溶液。

2.4 色谱条件的优化 为保证被定量化合物良好的分离度和适当的保留时间，本实验对磷酸的浓度、色谱柱的型号和流动相的梯度程序进行了考察，分别选用0.01%，0.02%，0.03%，0.05%，1.0%的磷酸溶液为流动相，比较不同浓度的磷酸对被分离化合物的分离度和峰形的影响，发现0.05%磷酸时，7个待测成分的峰形和分离度较好，因此本研究确定 0.05%磷酸；大黄药材中化学成分复杂，色谱图中有蒽醌类、苯丁酮苷类、二苯乙烯苷类、鞣质类等成分，为保证待测成分在具有良好分离度条件下出柱时间较短（本实验控制在70 min内），本研究考察了3种不同型号的150 mm色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）、Kromasil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 和DiamonsilTM C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm），研究发现应用Agilent ZORBAX SB-C18时待测成分的分离度最好，因此本研究选择的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18；为使番泻苷A与番泻苷B与相邻的色谱峰分开，本实验尝试了多个流动相梯度，最后确定为上述的梯度程序。应用以上所建立的色谱条件进行分析，所得到的对照品和样品的色谱图，见图1，14个被测化合物都实现了良好的分离。色谱图中的14个待测化合物的鉴别是通过对比保留时间、在线UV光谱以及加入对照品的方法完成的。

2.5 工作曲线的建立 大黄生长在海拔2 200～4 400 m的高原地带，生长环境多样，野生大黄的生长年份无从考证，其中各种化合物的化学成分差别很大，因此本实验所建立的各待测成分的工作曲线的线形范围都很宽。具体方法为将各对照品贮备液 分别稀释至6个不同浓度，得系列对照品溶液，每个浓度进样2次，取其峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标，进行回归分析，所得各回归方程见表2。

2.6 检测限和定量限 检测限是指从背景干扰中区分出被测定物的最低浓度，即信噪比为3時的样品浓度，定量限是信噪比为10时的样品浓度，各个被测物的检测限与定量限见表2。endprint

2.7 精密度试验 精密度的评价是通过测定各对照品的日内、日间精密度来实现的，各对照品分别选取高、中、低3个不同浓度，日内精密度的做法是在同一天内每个浓度重复测定6次，而日间精密度则是在连续的3 d每天每个浓度重复测定2次来完成的，通过计算相对标准偏差（RSD）来评价方法的重现性。结果表明，没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮、莲花掌苷、番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的日内精密度和日间精密度分别小于2.3%和3.1%。结果表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 精密称取唐古特大黄11号药材细粉6份，每份1 g，按照前面所描述的样品溶液制备及分析方法进行测定，结果得没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮、莲花掌苷、番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚14个成分的平均质量分数分别为0.04，0.02，0.32，0.56，8.09，4.05，1.58，0.82，2.11，1.23，0.33，0.08，0.21，0.06 mg·g-1。RSD分别为1.3%，1.2%，2.0%，2.4%，2.4%，2.4%，1.3%，1.9%，1.2%，2.4%，2.2%，3.6%，2.9%，3.2%，结果表明试验重复性良好。

2.9 稳定性试验 精密称取掌叶大黄药材细粉1 g，按照前面所描述的方法制成供试品溶液，分别间隔2，4，6，9，12 h进行测定，结果得没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮、莲花掌苷、番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的RSD分别小于1.7%，2.0%，1.5%，2.2%，3.0%，2.2%，1.8%，2.2%，2.9%，1.8%，2.0%，3.0%，3.3%，3.1%，表明样品在室温下放置12 h内稳定。

2.10 回收率试验 精密称取掌叶大黄药材细粉9份，每份0.5 g，分别加入高、中、低3个浓度的对照品混合液，每个浓度3份，按照前面所描述的样品溶液制备及分析方法进行测定，计算回收率和RSD，得没食子酸、儿茶素、（-）-表儿茶素-3-没食子酸酯、异莲花掌苷、4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮、莲花掌苷、番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、4′-羟基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-没食子酰基）-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率在91.80%～104.1%，RSD分别是2.1%～3.6%，3.6%～4.1%，2.4%～3.4%，3.1%～4.2%，2.8%～2.9%，3.1%～4.0%，3.7%～ 4.4%，3.9%～4.3%，1.9%～2.8%，1.5%～2.1%，2.8%～3.9%，2.2%～3.0%，1.2%～2.6%，1.7%～2.9%。

2.11 样品的含量测定 应用所建立的方法，测定了以上10个掌叶大黄合格样品10个唐古特大黄合格样品，见表3，从表中数据可以看出，掌叶大黄中含量比较高的成分是芦荟大黄素；唐古特大黄中含量比较高的是4-（4′-羟基苯基）-2-丁酮，各样品中所有化合物的含量差异都比较大，没有发现明显的比例关系。

3 讨论

本实验所用的36批掌叶大黄样品和39批唐古特大黄样品都是采自不同的海拔高度、不同的生长条件，为了考察所测定的14个指标成分在大黄中的分布特点，首先按照2015年版《中国药典》大黄项下质量标准对采集的样品中的指标成分进行了含量测定，选择了10批合格的药材，对这10批合格的药材进行了14个指标成分进行了含量测定，以评价大黄当中不同类别指标成分分布的特点，这些类别包括蒽醌类、蒽醌苷类、双蒽酮类、苯丁酮苷、鞣质、苯丁酮苷类，旨在对提升大黄的质量评价方法提供参考数据。

2015年版药典规定大黄有3种基原，包括掌叶大黄R. palmatum、唐古特大黄R. tanguticum和药用大黄R. officinale，但在实际的采样过程中发现，野生的药用大黄很少，采集的样品有限，因此本文只检测了2种主要存在的大黄，即掌叶大黄和唐古特大黄，而没有对药用大黄进行考察。

由于大黄中所含化学成分复杂，主要包括蒽醌类、苯丁酮苷类以及鞣质类，为了能较全面评价该药材质量，本实验除了对色谱条件进行优化，还重点对大黄的提取条件进行优化，包括提取溶剂、提取方式和提取时间。在提取溶剂方面，考察了30%，50%，60%，70%，100%甲醇溶液以及30%，50%，60%，70%，100%乙醇溶液，为了尽量全面的反应大黄化学信息的全面性，通过比较各种不同提取溶剂提取后所得到的色谱峰的峰面积，最终选择了70%甲醇溶液作为大黄的提取溶剂；提取方式采用了超声、加热回流和静置过夜这3种常用提取方法，通过比较色谱图中色谱峰的数量和峰面积，选择了超声提取法；在超声提取时间方面，结果表明超声1.0 h的提取效果和超声1.5 h 以及超声2.0 h的效果相似，因此选择超声提取时间为1.0 h。最终确定的提取方法为70%甲醇超声提取1.0 h。

本实验建立的高效液相色谱法实现了对大黄中14个指标成分的含量测定，确定了质量合格的唐古特大黄样品、掌叶大黄样品中14个化学成分的含量范围，为大黄质量控制水平的提高提供了可供借鉴的方法。虽然所定量这些成分的药理作用并不完全清楚，但是在目前大黄药效物质基础不明确的情况下，这种多指标含量测定相对于少数成分定量有利于控制大黄质量。实验中还发现，大黄中可能还含有其他含量比较高的成分，但是由于缺乏相应的对照品而無法进行含量测定，因此，化学对照品的缺乏是制约中药质量控制水平提高的关键问题之一。endprint

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部 [S]. 2015：23.

[2] 焦东海，杜上鉴.大黄研究[M].上海：上海科学技术出版社，2000：169.

[3] 黄娟， 张庆莲， 皮凤娟， 等. 大黄的药理作用研究进展[J]. 中国医院用药评价与分析， 2014， 14（3）：282.

[4] 李广峰. 大黄的药理作用及临床应用分析[J]. 中国医药指南， 2013（16）：317.

[5] 苟奎斌， 孙丽华， 娄卫宁， 等. 大黄中4种蒽醌类化合物抑幽门螺杆菌效果比较[J]. 中国药学杂志， 1997， 32（5）：278.

[6] 丁岩， 梁永钜， 陆豫， 等. 大黄素蒽醌衍生物介导KB及KBv200细胞氧化损伤的研究[J]. 中草药， 2004， 35（11）：1259.

[7] 刘诚， 郑艳艳， 洪芳， 等. 大黄素衍生物的合成及抗癌活性[J]. 高等学校化学学报， 2013， 34（6）：1408.

[8] Xue T， Roy R. Studying traditional Chinese medicine[J]. Science， 2003， 300（5620）：740.

[9] Ma Xueyi， Chen Yaozu， Hui Ruihua. Analysis of anthraquinones in Rheum franzenbachii Münt （rhubarb） by thin-layer chromatography[J]. Chromatographia， 1989， 27（9/10）：465.

[10] 周慧， 宋凤瑞， 刘志强， 等. ESI-MS和HPLC-UV法研究大黄、黄柏、赤芍炮制前后化学成分变化[J]. 药物分析杂志， 2009， 29（6）：883.

[11] Danielsen K， Francis G W. An alternative solvent system for the separation of anthraquinone aglycones from rhubarb on silica thin layers[J]. Chromatographia， 1994， 38（7/8）：520.

[12] 胡艳红. 高效毛细管电泳法测定三黄油擦剂中大黄素和大黄酚的含量[J]. 中医学报， 2012， 27（8）：981.

[13] Liu C L， Zhu P L， Liu M C. Computer-aided development of a high-performance liquid chromatographic method for the determination of hydroxyanthraquinone derivatives in Chinese herb medicine rhubarb[J]. J Chromatogr A， 1999， 857（1/2）：167.

[14] Koyama J， Morita I， Kobayashi N. Simultaneous determination of anthraquinones in rhubarb by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A， 2007， 1145（1/2）：183.

[15] Weng Wu-Che， Sheu Shuenn-Jyi. Separation of anthraquinones by capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography[J]. J Sep Sci， 2015， 23（2）：143.

[16] Koyama J， Morita I， Kawanishi K， et al. Capillary electrophoresis for simultaneous determination of emodin， chrysophanol， and their 8-beta-D-glucosides[J]. Chem Pharm Bull， 2003， 51（4）：418.

[17] Koyama J， Morita I H， Kobayashi N. Simultaneous determination of anthraquinones， their 8-beta-D-glucosides， and sennosides of Rhei Rhizoma by capillary electrophoresis[J]. Chem Pharm Bull， 2005， 53（5）：573.

[18] Sun S W， Yeh P C. Analysis of rhubarb anthraquinones and bianthrones by microemulsion electrokinetic chromatography[J]. J Pharmaceut Biomed， 2005， 36（5）：995.

[責任编辑 孔晶晶]endprint