人工打洞沉香中1个新的倍半萜

邝彤东+陈惠琴+李薇+杨锦玲+周丽曼+蔡彩虹+董文化+梅文莉+戴好富

[摘要] 运用多种色谱技术，对人工打洞沉香乙醇提取物的正丁醇相进行化学成分分离，并根据波谱数据结合理化性质共鉴定了7个单体化合物的结构，分别为selina-3，11-dien-9，15-diol （1）、aquilarone D （2）、5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy- 2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）、6，7-dimethoxy-2- [2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）、syringin （5）、顺式对羟基肉桂酸甲酯 （6）和4′-甲氧基肉桂酸 （7），其中化合物1为新的倍半萜类化合物，化合物5～7为首次从沉香中分离得到。生物活性测试结果表明化合物6，7对全齿复活线虫具有较好的致死活性，化合物4，6，7对人肝癌细胞株BEL-7402、人胃癌细胞株SGC-7901和人肺癌细胞株A549的生长有不同程度的抑制作用。

[关键词] 沉香； 正丁醇相； 倍半萜； 生物活性

[Abstract] In order to study the chemical constituents of n-butanol fraction of ethanol extract from Chinese agarwood induced by artificial holing， various chromatographic techniques were carried out to isolate compounds， and the structures of compounds were determined through a combined analysis of physicochemical properties and spectroscopic evidence. Seven compounds were obtained and identified as selina-3，11-dien-9，15-diol （1）， aquilarone D （2）， 5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）， 6，7-dimethoxy-2-[2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）， syringin （5）， methyl （Z）-p-coumarate （6）， and 4′-methoxycinnamic acid （7）， among which compound 1 was a new compound and compounds 5-7 were isolated from agarwood for the first time. The bioactivity assay results concluded that compounds 6 and 7 showed certain nematicidal activity against Panagrellus redivivus， and compounds 4， 6 and 7 exhibited cytotoxicity against BEL-7402， SGC-7901 and A549 carcinoma cell lines.

[Key words] agarwood； n-butanol extract； sesquiterpene； biological activity

沉香为瑞香科Thymelaeceae沉香属Aquilaria或拟沉香属Gyrinops植物受伤后产生的含树脂的干燥芯材[1]。白木香A. sinensis （Lour.）Gilg为我国特有的沉香基原植物，主要生长于海南、福建、广东、广西等地区[2]。沉香入药已有两千多年历史，其味辛、苦，性微温，具有降气温中，暖肾纳气的功效[3-4]。现代药理研究表明，沉香在抗肿瘤、降血脂、抗菌消炎、镇静安神等[5-9]方面具有一定的作用。据文献报道，沉香的特征性化学成分为多种骨架类型的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类化合物[10]，目前相关研究主要集中于野生沉香，而针对人工沉香的研究相对缺乏。随着野生沉香资源变得日益匮乏，人工沉香能否代替野生沉香的问题变得尤为重要，所以本课题对人工沉香重要来源之一的人工打洞沉香进行深入研究。

本研究组前期从国产人工打洞沉香的乙酸乙酯相分离鉴定了一系列结构新颖并具有一定生物活性的化合物[11-12]。在此基础上，本研究首次针对国产人工打洞沉香的正丁醇相进行化学成分研究，从中分离鉴定了7个单体化合物（图1），其中化合物1为新的倍半萜类化合物。结合人工打洞沉香乙酸乙酯相与正丁醇相分离得到的化合物，可以为更好地评价人工打洞沉香的品质提供理论基础。

1 材料

安捷伦1260分析型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；戴安SUMMITP680A半制备高效液相色谱仪（美国戴安公司）；HR-ESI-MS质谱仪（瑞士布鲁克公司）；ESI-MS质谱仪（瑞士布鲁克公司）；布鲁克AV-500核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；ELX-800酶标仪（美国宝特公司）；薄层色谱硅胶板和柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（德國默克公司）；D101型大孔吸附树脂（山东鲁抗医药股份有限公司）；N-1000（2L）立式旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；超纯水装置（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；1/1万电子秤（北京赛多利斯天平有限公司）；浓硫酸（淄博滨岭化工有限公司）；核磁共振用氘代试剂（德国默克公司）；常用AR级试剂购买自广州化工和天津大茂等公司；色谱纯试剂购买于天津四友和天津康科德等公司；紫杉醇购于江苏红豆杉药业有限公司；人肝癌细胞株BEL-7402、人胃癌细胞株SGC-7901和人肺癌细胞株A549均购于中山大学实验动物中心细胞库。endprint

结香4年人工打洞沉香（4.7 kg）于2012年11月采自云南省西双版纳傣族自治州，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定其基源植物为白木香A. sinensis，样本保存在中国热带农业科学院热带生物技术研究所（标本编号AW20121108）。

2 提取与分离

人工打洞沉香样品（4.7 kg）粉碎后用95%乙醇（15.0 L）回流提取3次，减压浓缩得到浸膏（510.0 g）。随后将浸膏分散至水中，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次。浓缩后将正丁醇相浸膏（199.0 g）经大孔吸附树脂D101吸附后用甲醇洗脱浓缩得浸膏92.0 g，再将该浸膏经减压硅胶柱色谱进行分离，以氯仿-甲醇系统（1∶0～0∶1）梯度洗脱，浓缩后经TLC薄层色谱检测，合并显色剂显色和Rf相同的部分，得10个流分（Fr.1～10）。Fr. 2（氯仿-甲醇80∶1洗脱流分，2.5 g）先经RP-18柱色谱以甲醇-水（2∶3～1∶0）为流动相进行梯度洗脱，得到9个流分（Fr.2.1～2.9）。Fr.2.3（甲醇-水2∶3洗脱流分，189.0 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相进行洗脱得3个流分（Fr.2.3.1～2.3.3）。Fr.2.3.2（87.8 mg）再经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统（100∶1，20∶1，10∶1，3∶1）为流动相洗脱得4个流分（Fr.2.3.2.1～2.3.2.4）。Fr.2.3.2.2（石油醚-乙酸乙酯100∶1洗脱流分，16.2 mg）再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以石油醚-氯仿-甲醇（2∶1∶1）系统为流动相洗脱得2个流分（Fr.2.3.2.2.1～2.3.2.2.2）。Fr.2.3.2.2.2（10.2 mg）经半制备型HPLC（C18柱；45%甲醇-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波長254 nm）分离得化合物6（3.0 mg）和7（3.6 mg）。Fr.2.4（甲醇-水1∶1洗脱流分，53.0 mg）经半制备HPLC（C18柱；30%乙腈-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波长254 nm）分离得化合物1（1.5 mg）。Fr.2.6（甲醇-水3∶2洗脱流分，585.0 mg）有白色固体析出，用甲醇重结晶后其母液部分浓缩得471.1 mg，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱以甲醇为流动相洗脱得4个流分（Fr.2.6.1～2.6.4）。Fr.2.6.2（118.0 mg）经半制备HPLC（C18柱；45%甲醇-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波长254 nm）分离得化合物4（4.7 mg）。

Fr.8（氯仿-甲醇5∶1洗脱流分，14.9 g）首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱以甲醇作为流动相除去色素，剩余样品（11.9 g）经RP-18柱色谱以甲醇-水（2∶3～1∶0）系统为流动相进行梯度洗脱，得9个流分（Fr.8.1～8.9）。Fr.8.1（甲醇-水2∶3洗脱流分，441.5 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相洗脱得4个流分（Fr.8.1.1～8.1.4）。Fr.8.1.2（21.3 mg）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯系统（1∶10）洗脱得3个流分（Fr.8.1.2.1～8.1.2.3）。Fr.8.1.2.2（石油醚-乙酸乙酯1∶10洗脱流分，4.6 mg）经过半制备HPLC（C18柱；30%甲醇-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波长254 nm）分离得化合物5（3.4 mg）。Fr.8.1.4（164.8 mg）经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇系统（30∶1，25∶1，10∶1）为流动相洗脱得4个流分（Fr.8.1.4.1～8.1.4.4）。Fr.8.1.4.2（氯仿-甲醇25∶1洗脱流分，12.9 mg）经半制备HPLC（C18柱；30%甲醇-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波长254 nm）分离得化合物2（2.8 mg）。Fr.8.2（甲醇-水2∶3洗脱流分，6.3 g）取部分样品（135.0 mg），直接经半制备HPLC（C18柱；30%甲醇-水系统为流动相；流速4 mL·min-1；检测波长254 nm）分离得化合物3（2.2 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 黄色油状物（CHCl3）；HR-ESI-MS m/z 259.166 6[M+Na]+（计算值为259.166 9），结合1H-NMR和13C-NMR 数据，确定其分子式为C15H24O2，不饱和度为4。化合物的1H-NMR（CDCl3，500 MHz）谱中呈现2个甲基单峰信号δH 1.76（3H，s）和0.80（3H，s），3个烯氢信号δH 4.73（1H，br s），4.74（1H，br s）和5.67（1H，s），3个连氧碳上的氢信号δH 3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz），3.98（1H，d，J=12.3 Hz）和4.12（1H，d，J=12.5 Hz）。化合物的13C-NMR（DEPT）谱中显示有15个碳信号，其中包含4个双键碳信号，其余的碳信号中含有2个甲基碳（δC 20.9和10.1），5个亚甲基碳（δC 22.4，27.5，32.8，35.1，65.9）包含1个连氧碳，3个次甲基碳（δC42.9，43.6，78.0）包含1个连氧碳，1个季碳（δC37.6）。通过上述分析，并与文献[13]中的化合物（5S，7S，9S，10S）-（+）-selina-3，11-dien-9-ol对比，发现两者差别仅在于已知化合物的14位甲基被氧化为羟甲基，即已知化合物的14位信号[δH 1.63（3H，s）； δC 21.7]被化合物1中的信号[δH 4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b）； δC 65.9]所取代，所以该化合物也推断为桉烷型骨架的倍半萜。另外根据二维波谱数据（图2），在HMBC谱中，H2-14与C-3，C-4，C-5有相关，进一步证明了14位羟甲基的存在；H-12与C-7，C-11，C-13有相关，H-13与C-7，C-11，C-12有相关，表明异丙烯基的存在，并连接在C-7位上。再结合HSQC和1H-1H COSY相关谱推导出化合物1的结构见图2。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ： 5.67（1H，s，H-3），4.74（1H，br s，H-12a），4.73（1H，br s，H-12b），4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b），3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz，H-9），2.07-2.11（4H，m，H-2a，2b，5，7），1.93～1.96（1H，m，H-1a），1.85（2H，m，H-6a，8a），1.76（3H，s，H-13），1.58（1H，J=11.7 Hz，H-8b），1.25（1H，m，H-1b），1.21（1H，m，H-6b），0.80（3H，s，H-15）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ： 32.8（C-1），22.4（C-2），124.3（C-3），137.4（C-4），43.6（C-5），27.5（C-6），42.9（C-7），35.1（C-8），78.0（C-9），37.6（C-10），149.2（C-11），109.2（C-12），20.9（C-13），65.9（C-14），10.1（C-15）。综上所述，化合物1的结构鉴定为selina-3，11-dien-9，15-diol，经查阅文献，该化合物为新化合物。endprint

4 生物活性测试

采用贝曼漏斗法[20]和MTT法[21]分别测定了化合物1～7全齿复活线虫致死活性和细胞毒活性（表3）。

5 结果与讨论

本研究组前期对人工打洞沉香的乙酸乙酯相进行化学成分研究，从中分离鉴定了76个化合物，其中18个倍半萜类化合物，50个2-（2-苯乙基）色酮类化合物和8个其他类化合物[11-12]。在此基础上，本研究通过多种柱色谱技术首次对人工打洞沉香正丁醇萃取相的化学成分进行研究，分离得到7个化 合物，其中1个新倍半萜类化合物（1），3个2-（2-苯乙基）色酮类化合物（2～4），3个苯丙素类化合物（5～7），其中化合物5～7为首次从沉香中分离得到。生物活性测试结果显示化合物6和7对全齿复活线虫具有较好的致死活性，化合物4和6分别对人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549的生长均有一定的抑制作用，化合物7对人胃癌细胞株SGC-7901的生长有较弱的抑制活性。研究结果为沉香的进一步开发利用提供了科学依据。

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[责任编辑 丁广治]endprint