茜草炭不同极性部位化学成分组成及保护氧化损伤活性比较

肖林焱+王海丽+陈毅+张丽+程芳芳+单鸣秋+丁安伟

[摘要] 采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 损伤模型，MTT 比色法测定细胞活力，评价茜草炭不同极性部位提取物的抗氧化损伤活性，同时采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS） 对各极性部位化学成分进行定性研究。结果显示，乙酸乙酯部位与正丁醇部位均可显著提高细胞活力（P<0.01），石油醚部位对细胞活力影响不大，水提取部位对损伤的HUVECs有一定的抑制作用。UPLC-Q-TOF-MS分析结果显示，从茜草炭4个极性部位提取物中共鉴定化合物32种，包括31种醌类及其糖苷类和1个烯萜（茜草哌唑嗪C），石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位分别鉴定出化合物23，32，26，15种。关联体外细胞实验结果表明，乙酸乙酯部位和正丁醇部位为茜草炭抑制ox-LDL诱导HUVECs损伤的有效部位，为阐明茜草炭的药效物质基础提供科学依据，为茜草炭功效-物质相关性研究奠定基础。

[关键词] 茜草炭； 极性部位； 化学成分定性； 细胞损伤； ox-LDL

[Abstract] The protective effect of different polar fractions of Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （cRRR） against ox-LDL-induced damage to human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） was investigated by MTT assay， and the components were identified by using UPLC-Q-TOF-MS. According to the study， ethyl acetate extract and n-butanol extract could increase cell viability （P<0.01）， while petroleum ether extract had no influence， and water extract could even inhibit the cell viability to some degree. Moreover， 32 compounds in four polar fractions were analyzed， including 31 quinones and their glycosides， and one rubiprasins C. Petroleum ether extract， ethyl acetate extract， n-butanol extract and water extract contained 23， 32， 26， 15 compounds， respectively. According to cell experiments in vitro， active fractions were ethyl acetate extract and n-butanol extract. The results could provide scientific references for further studies on effective material basic of cRRR， and lay a foundation for studies on the relationship between efficacies and materials.

[Key words] Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （cRRR）； polar fraction； compound identification； cell injury； ox-LDL

茜草炭是由茜草科茜草属植物茜草Rubia cordifolia L. 的干燥根和根茎经炒炭炮制而成[1]，茜草具有凉血化瘀止血、活血通经的功效，炒炭后寒性减弱，澀性增加，止血作用增强，具有“化瘀”、“止血”双向调节作用，临床上主要用于治疗由瘀血阻滞引起的吐血、崩漏、外伤出血等出血症[2]。

本课题组前期从血液流变学、血小板功能、凝血4项以及纤溶系统的影响等多方位考察了茜草炭不同提取方式提取物对急性血瘀模型大鼠和子宫出血模型大鼠的化瘀止血功效[3-4]，但其功效成分仍有待进一步研究。文献研究表明，茜草炭，血管内皮细胞的损伤及功能障碍是多种出血证的起始因素，内皮细胞受多种因素刺激致损伤后，会引发一系列氧化应激、炎症反应[5]，对损伤内皮细胞的保护作用可以有助于揭示中药活性组分的止血作用与机制。

本实验采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，比较不同极性部位提取物对损伤内皮细胞活力的影响，同时结合UPLC-Q-TOF-MS对各极性部位化学成分进行定性分析，以期为阐明茜草炭活性部位化瘀止血的药效物质基础提供一定依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

Triple TOFTM5600型超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱，电喷雾离子源（ESI），Analyst1.6 色谱工作站，PeakView质谱分析软件（美国AB公司）；KH-500B超声机（昆山禾创超声仪器有限公司）；Hangping FA1104N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司，d=0.1 mg）；MS105DU型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司，d=0.01 mg）；Milli-QDirect 8 超纯水仪（美国Millipore公司）。SWCJ-IF型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、倒置显微镜（日本Olympus 公司）、恒温二氧化碳培养箱（Thermo公司）、全自动酶标仪（Bio-Rad公司）。endprint

甲醇（质谱纯，美国MERCK公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技发展有限公司）；甲酸（质谱纯，美国MERCK公司）；超纯水（Milli-Q Direct 8超纯水）。DMEM高糖培养基（Gibco公司）、胎牛血清（Gibco公司）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）、生物学DMSO（Sigma公司）、PBS（Hyclone公司）、MTT（Solarbia公司）。

1.2 药品

茜草购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为茜草科植物茜草R. cordifolia的干燥根和根茎。茜草炭按2015年版《中国药典》一部有关要求炒制而成。

茜草素、甲基异茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、1-羟基-2-甲基蒽醌均为自制，经HPLC检测纯度≥98%，羟基茜草素（南京森贝伽生物科技有限公司，纯度≥98%），大叶茜草素（中国食品药品检定研究院，批号110884-200604，纯度≥98%）。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）（广州奕源生物科技有限公司，批号 YB-002-1）。

1.3 细胞株

人脐静脉内皮细胞株（ human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 购于上海拜力生物公司。

2 方法

2.1 供试品与对照品溶液的制备

2.1.1 茜草炭不同极性部位制备 取茜草炭1 630 g，采用先醇提后水提的复合提取法[3]，得茜草炭复合物312.6 g，而后采用系统溶剂提取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水对其进行提取，真空减压干燥，分别得石油醚部位浸膏16.3 g（得率1.00%）、乙酸乙酯部位浸膏28.1 g（得率1.72%）、正丁醇部位浸膏34.1 g（得率2.09%）、水部位浸膏213.3 g（得率13.09%）。

2.1.2 供试品溶液的制备 分别称取茜草炭石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位浸膏适量（分别相当于生药量1 g），置10 mL量瓶中，加80%甲醇超声至溶解后稀释至刻度。13 000 r·min-1离心10 min，取上清，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 分别取大叶茜草素、羟基茜草素、茜草素、甲基异茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、1-羟基-2-甲基蒽醌适量，置5 mL量瓶中，80%甲醇溶解制成对照品溶液。再分别取各对照品溶液0.8 mL，置5 mL量瓶中，加80%甲醇制成各成分质量浓度分别为25 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2 LC-Q-TOF-MS定性分析

2.2.1 色谱条件 Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0～1 min，90% A；1～4 min，90%～65% A；4～9 min，65%～40%A；9～15 min，40%～30%A；15～20 min，30%～10%A；20～22 min，10%～90%A；22～24 min，90%A），柱温30 ℃，流速0.2 mL·min-1，进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI），扫描范围m/z 50～1 500，正负离子模式下采集数据。离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V；雾化气（Gas1）55 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅助气（Gas2）55 psi；气帘气（CG）40 psi；去簇电压（DP）60 V；一级碰撞电压（CE）10 V；二级碰撞电压（CE）35 V。

2.3 不同极性提取物对HUVEC活力的影响

2.3.1 细胞培养 用含10%的Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养。每2 d换1次液，4～5 d传代1次。选取2～8代进行实验。

2.3.2 ox-LDL诱导HUVEC损伤模型的建立以及給药浓度的筛选 取对数生长期细胞，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化后，轻轻吹打，用含10%胎牛血清高糖DMEM培养液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，均匀接种于96孔板，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h，使细胞贴壁呈单层融合，弃去上清液，2块板分别进行筛选试验：①分别给予细胞终浓度为6.25，12.5，25，50，100 mg·L-1的ox-LDL，100 μL/孔，每组设6个复孔；②分别给予细胞终浓度为12.5，25，50，100，200 mg·L-1茜草炭不同极性部位提取物，100 μL/孔，每组设4个复孔，再于37 ℃，5%CO2条件下培养24 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，继续在培养箱中避光培养4 h后，轻轻吸弃孔内液体，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡器轻轻混匀10 min后，于酶标仪上490 nm处读取各孔吸光度，按下式计算给药后对HUVEC生长的存活率。

存活率=A给药组-A空白组

A对照组-A空白组×100%

2.3.3 茜草炭不同极性部位提取物对损伤HUVECs活力影响 取对数生长期细胞，将其消化后均匀接种于96孔板，种板步骤按2.3.2项，将细胞随机分为①正常对照组：给予细胞10%胎牛血清高糖DMEM培养液；②ox-LDL模型组：给予细胞浓度为25 mg·L-1的ox-LDL；③茜草炭不同极性部位提取物组：分别给予细胞终浓度为25 mg·L-1茜草炭不同极性部位提取物的同时加入终浓度为25 mg·L-1的ox-LDL，100 μL/孔，每组设6个复孔，再于37 ℃，5%CO2条件下培养24 h后，MTT法检测细胞活力按2.3.2项。endprint

2.3.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行处理，实验数据均以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

3 结果与分析

3.1 LC-Q-TOF/MS定性分析

通过查阅国内外相关文献，建立茜草炭化学成分库，运用peak view软件对茜草炭4种极性部位提取物中化学成分一级质量数进行匹配，筛选质量数偏差≤5×10-6的化合物，然后对其二级谱图进行解析，依据文献报道的相关化合物碎片离子与判断化合物裂解方式是否符合该类化合物裂解规律。

茜草炭各极性部位提取物总离子流图见图1，多数化合物在正负离子模式下均有较高响应，但也有少数化合物只在某一种离子模式下有响应，所以本实验对供试品溶液进一步进行了正离子和负离子模式的检测。

茜草炭中的化学成分主要为醌类化合物，其离子碎片大多以分子离子失去1个或多个羰基（CO）为主，在没有取代基的情况下，萘醌和蒽醌都会连续失去2个CO；在有取代基的情况下，蒽醌类化合物主要的裂解途径亦为逐级脱CO[6]；醌苷类成分主要裂解途径是糖苷键断裂，失去糖。本实验共鉴别出化合物32个，除了1个烯萜（茜草哌唑嗪C），其他31个化合物均是醌类及其糖苷类成分，分别为 5个萘醌、1个萘醌苷、17个蒽醌和8个蒽醌苷，见表1，其中茜草素、羟基茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、甲基异茜草素、1-羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素由对照品比对鉴定，茜草素的质谱图和可能的裂解过程见图2。

通过比较4个极性部位化学成分种类发现，在解析的化合物范围内，茜草炭乙酸乙酯部位鉴定出的化学成分种类最多有32种，正丁醇部位、石油醚部位次之，分别为26种、23种；水提取部位最少，鉴定出15种化合物。同时，由于逐级系统溶剂提取的缘故，化合物基本都分布在前3个极性部位。石油醚部位主要是一些小极性物质，如2-甲基蒽醌，1-羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素、1-羟基-3-乙基蒽醌等；乙酸乙酯部位主要是一些中等极性物质，如异茜草素、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、羟基茜草素、甲基异 茜草素等；正丁醇部位主要是一些较大极性物质（蒽醌及蒽醌苷），如1-羟基-2-甲基蒽醌、1，4-二羟基-2-甲基-5/8-甲氧基蒽醌、1，4-二羟基-3-（3′-甲基-2′-丁烯）萘-2-羧酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1→2）-β-D-（6′-O-乙酰基）-吡喃葡萄糖苷；水提取部位化学成分主要为一些大极性物质（蒽醌苷），如1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-（3′/4′/6′-O-乙酰基）-吡喃葡萄糖苷。

3.2 不同极性部位提取物对HUVEC活力的影响

3.2.1 ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型的建立 6.25，12.5，25，50，100 mg·L-1ox-LDL处理组细胞存活率分别83.38%，61.10%，48.23%，10.04%，9.27%，与正常组（100%）相比，在一定范围内，随着ox-LDL浓度的增加，细胞存活率明显下降，见图3。当ox-LDL的质量浓度为10 mg·L-1时，差异有统计学意义，IC50约为25 mg·L-1，在此条件下细胞损伤适中，因而确定25 mg·L-1为ox-LDL诱导HUVECs损伤的剂量。

3.2.2 茜草炭不同极性部位提取物对HUVEC的体外毒性实验 为了检测茜草炭提取物能否对HUVECs细胞产生毒性作用，本实验选用12.5，25，50，100，200 mg·L-15个剂量浓度的各极性部位提取物作用于对数生长期的HUVECs细胞，作用24 h后，通过MTT检测其存活率，以药物对细胞的抑制率在10%以内为标准确定茜草炭各极性部位提取物对细胞无毒的浓度[28]。与正常组比较，25 mg·L-1的茜草炭各极性部位提取物未对正常HUVECs细胞的生长增殖产生较大的影响，均无明显毒副作用，见图4。因此，此剂量可作为茜草炭各极性部位提取物的给药剂量。

3.2.3 MTT法检测茜草炭各成分群对损伤HUVECs活力影响 ox-LDL损伤后，与正常组比较，模型组细胞的存活率（47.04%）明显降低（P<0.01），表明ox-LDL可明顯抑制HUVECs活性；与模型组比较，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位存活率分别为54.64%，82.22%，67.05%，34.09%，乙酸乙酯部位与正丁醇部位均可显著提高细胞活力（P<0.01），而石油醚部位对细胞活力影 响并不大，水提部位对损伤的HUVECs有一定的抑制作用，见图5。提示茜草炭4个极性部位提取物化学成分的不同导致其对ox-LDL损伤的HUVECs活力的影响不同，乙酸乙酯部位与正丁醇部位具有 明显的保护作用，乙酸乙酯-正丁醇极性部位提取物中所含化学成分很可能为发挥茜草炭化瘀止血作用的有效成分。

4 讨论

茜草炭具有“止血不留瘀”的功效特点，为临床常用的止血药，主要用于瘀血内阻而导致的出血症，如咯血、血痢、尿血、崩漏等。止血是一个有多种细胞或成份共同参加的一个复杂的连续性过程，而多种内外致病因素导致的血瘀证以及出血证与血管内皮细胞损伤有着密切的关系[29]。血管内皮细胞不仅是血液和血管的屏障，而且能通过分泌各种血管活性物质，参与调节血小板功能、激活血浆促凝因子、清除活化的凝血因子及纤溶过程，对维持正常的血液流变性和血管的舒缩功能具有重要生理学意义[30]。

本实验采用ox-LDL诱导HUVECs损伤模型，研究各极性部位提取物对损伤HUVECs的保护作用，结果表明，乙酸乙酯部位提取物能明显提高损伤HUVECs的活性，正丁醇次之，关联LC-Q-TOF-MS定性数据，乙酸乙酯部位含有鉴定出的所有32种化合物，正丁醇部位含有26种，其对损伤内皮细胞的保护作用的差异可能与化合物的种类与极性有关。茜草炭发挥化瘀止血的活性成分可能主要集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的蒽醌及其苷类化合物，这些化合物能通过提高细胞活力达到一定保护内皮细胞的作用，为后续探究茜草炭化瘀止血活性成分对损伤内皮细胞保护作用的具体作用机制奠定基础，对阐明其化瘀止血功效的物质基础及临床合理应用具有重要意义。endprint

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[责任编辑 孔晶晶]endprint