卵巢浆液性腺癌中抑癌基因WWOX和PTEN的表达及临床意义

吴铃+叶健文+林舟

[摘要] 目的 研究抑癌基因WWOX及PTEN对卵巢浆液性腺癌细胞生长的影响，探讨卵巢癌基因治疗的新靶点。 方法 于2013年10月—2016年10月福州市第一医院方便选取的60例卵巢浆液性腺癌标本作为研究对象，另选取30例正常卵巢组织作为对照。采用免疫组化检测抑癌基因WWOX及PTEN的阳性率表达，RT-PCR法测WWOX及PTEN的mRNA相对表达量。 结果 卵巢浆液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的免疫组化阳性率及mRNA相对表达量均显著低于正常卵巢组织组（P<0.05）。 结论 WWOX及PTEN基因缺失可能是卵巢浆液性腺癌发生的重要分子基础，可能会干扰卵巢癌细胞的细胞周期并抑制其生长增殖，临床研究有待从基因分子调控等方面进一步深入探讨，为卵巢浆液性腺癌的基因治疗提供一种新方法。

[关键词] 浆液性腺癌；抑癌基因；WWOX；PTEN

[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）11（c）-0023-03

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of WWOX and PTEN on the growth of ovarian serous adenocarcinoma cells and to explore the new target of ovarian cancer gene therapy. Methods From October 2013 to October 2016， 60 cases of ovarian serous sex adenocarcinoma were selected from fuzhou first hospital，30 other normal ovarian tissue were selected as the control.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR. Results The immunohistochemical positive rate of mRNA and mRNA expression of WWOX and PTEN in ovarian serous adenocarcinoma were significantly lower than those in normal ovarian tissue （P<0.05）. Conclusion WWOX and PTEN may interfere with the cell cycle of ovarian cancer cells and inhibit their growth and proliferation， which may provide a new method for gene therapy of ovarian serous adenocarcinoma. WWOX and PTEN gene deletion may be an important molecular basis for the development of ovarian serous adenocarcinoma. Clinical research needs to be further explored in terms of gene molecular regulation.

[Key words] Serous adenocarcinoma； Tumor suppressor gene； WWOX； PTEN

卵巢浆液性腺癌发病率居我国妇科恶性肿瘤前列，是卵巢上皮性癌中最常见的组织学类型。目前卵巢浆液性腺癌有逐年增高的趋势。不同级别的卵巢浆液性腺癌其发生机制可能不同，而在多种肿瘤发生中，WWOX及PTEN均表达下降或缺失，参与了肿瘤的形成[1]。该研究通过检测卵巢浆液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的表达情况，探讨卵巢癌基因治疗的新靶点并探讨其对预后的可能影响，方便选取2013年10月—2016年10月福州市第一医院的手术切除并经病理确诊的60例卵巢浆液性腺癌标本为研究对象，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取福州市第一医院的手术切除并经病理确诊的60例卵巢浆液性腺癌标本。患者年龄在 34～72岁之间，平均年龄 50岁。另选取正常卵巢组织30例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 试剂 WWOX（C7）小鼠抗人单克隆抗体（稀释度1：100）和PTEN（6H2.1） 小鼠抗人單克隆抗体（稀释度1：100）分别购自 Santa Cruz 公司和福州迈新公司。

1.2.2 免疫组化 免疫组化染色采用 EliVision两步法。按试剂盒说明书的具体操作步骤进行。阴性对照以PBS代替一抗，以正常卵巢组织作阳性对照。其中以苏木精轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察。

1.2.3 结果判定 WWOX染色 以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，PTEN染色：以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。以阳性细胞百分比计分：阳性细胞数>75%计为4分，阳性细胞数50%～75%计为3分，阳性细胞数25%～50%计为2分，阳性细胞数<25%计为1分，没有阳性细胞计为0分。以每张切片的大多数细胞染色特征来决定染色强度标准：出现棕黄色颗粒为3分，出现黄色颗粒为2分，出现淡黄色颗粒为1 分，无染 色为0分。两项结果相加：0分：（-），2～3分：（+），4～5分：（++），6～7分：（+++）；（ +～+++）均为阳性。endprint

1.2.4 RT-PCR 采用異硫酸氰酸胍一步法提取组织总RNA；总RNA的鉴定；反转录合成cDNA；PCR反应；采用凝胶分析软件（BIO-LD）进行定量，各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值表示目的基因相对表达量。

1.2.5 统计方法 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计学处理和分析，计量资料比较采用方差分析，计数资料的比较采用χ2检验，并分别用（x±s）、[n（%）]表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WWOX 在卵巢浆液性肿瘤中的表达

检测结果显示，30例正常卵巢组织中WWOX免疫组化阳性化表达为90.0%（27/30）。明显高于60例浆液性腺癌中WWOX 免疫组化阳性率（48.7%），差异有统计学意义（P<0.05）。半定量 RT-PCR结果显示卵巢浆液性腺癌中WWOX mRNA相对表达量为（0.23±0.05）显著低于正常卵巢组织组（0.58±0.07）（P<0.05），见表1、图1。

2.2 PTEN在卵巢浆液性肿瘤中的表达

PTEN的 免疫组化检测结果显示，30例正常卵巢组织中PTEN免疫组化阳性化表达为93.3%（28/30）。明显高于60例浆液性腺癌中PTEN阳性率（50.8%），差异有统计学意义（P<0.05）。卵巢浆液性腺癌中 PTEN mRNA相对表达量为（0.25±0.04），显著低于正常卵巢组织组的（0.61±0.06）（P<0.05），见表2、图2。

3 讨论

近年来肿瘤研究中的热点为癌基因的激活和抑癌基因的失活，而卵巢浆液性腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤，具有预后差，病死率高的特点，因此该疾病一直是医护人员关注的焦点[2]。2000年，由Bednarek应用鸟枪基因测序技术分离并鉴定出了一种WWOX基因，其基因定位于人类16q23.3～24.1的染色体上，且对整个常见染色体脆性位点FRA16D进行了跨越，蛋白质编码共包含羧基末端的1个短链脱氧/还原酶结构域（SDR）和氨基端的2个WW结构域[3]。WWOX抑癌基因通过使酪氨酸33位点磷酸化而致功能活化，下调凋亡抑制因子，同时上调p53基因蛋白表达，使TNF细胞毒作用进行增强，并形成复合物，从而相互作用，起到抑制癌细胞的作用[4-6]。Nunez等[7]研究中显示，正常卵巢组织中WWOX抑癌基因始终为强阳性表达，而卵巢癌中不仅组织分型中存在差异，且至少有37%减少或无法检测出。该次研究结果显示，30例正常卵巢组织中WWOX免疫组化阳性化表达为90.0%（27/30）。明显高于60例浆液性腺癌中WWOX 免疫组化阳性率（48.7%），差异有统计学意义（P<0.05），卵巢浆液性腺癌中WWOX的免疫组化阳性率及mRNA相对表达量均显著低于正常卵巢组织组，半定量 RT-PCR结果显示卵巢浆液性腺癌中WWOX mRNA相对表达量为（0.23±0.05）显著低于正常卵巢组织组（0.58±0.07），差异有统计学意义（P<0.05）。因此，该实验认为WWOX基因表达缺失或降低可能在卵巢浆液性腺癌的发生、发展中发挥一定作用。

PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因之一[8]。主要表现为基因缺失、蛋白表达减少，可通过DNA甲基化以及基因突变等方式失活，调控细胞增殖，抑制细胞迁移，从而在肿瘤的发生、发展中发挥重 要作用[9]，因此PTEN基因失活在卵巢癌的发生中可能起一定的作用，可以认为PTEN 基因下调可能是卵巢癌发生的重要分子生物学基础。实验研究也表明，卵巢浆液性腺癌中PTEN基因的免疫组化阳性率及mRNA相对表达量均显著低于正常卵巢组织组（P<0.05）。因此，该研究认为PTEN基因失活与卵巢癌的发生存在一定的重要关联。

综上所述，抑癌基因WWOX及PTEN可能会干扰卵巢癌细胞的细胞周期并抑制其生长增殖，临床研究有待从分子调控等方面进一步深入探讨，以期为今后的卵巢浆液性腺癌基因防治提供新的作用靶点，为卵巢浆液性腺癌的基因治疗提供一种新方法。

[参考文献]

[1] 焦丹，甘雨良，李军.卵巢浆液性腺癌的超声表现与其临床病理特征相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志，2015（b22）：227-228.

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[6] Iiopoulos D，Guler G，Han SY，et al.Fragile genes as biomarkers ：epigenetic control of WWOX and FH IT in lung，breast and bladder cancer[J].Oncogene，2005，4（9）：1625-1633.

[7] Nunez MI ，Rosen DG，Ludes-Meyers JH，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlates with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64.

[8] PS Tanwar，G Mohapatra，S Chiang，et al.Loss of LKB1 and PTEN tumor suppressor genes in the ovarian surface epithelium induces papillary serous ovarian cancer[J]. Carcinogenesis ，2014，35（3）：546-553.

[9] Blanco-Aparicio C，Renner O，Leal J F，et al.PTEN，more than the akt pathway[J].Carcinogenesis，2007，28（7）：1379-1386.

（收稿日期：2017-08-25）endprint