L02脂肪变模型中氧化应激的发生及羊栖菜多糖的干预作用

吴利敏+夏盛隆+申苏建+夏宣平+薛战雄+蒋益

[摘要] 目的 建立人正常肝细胞株（L02）脂肪变模型，探讨软脂酸（PA）对肝细胞氧化应激的作用及羊栖菜多糖（SFPS）对脂肪变肝细胞氧化还原系统的影响。 方法 采用0.5 mmol/L的PA诱导L02细胞建立脂肪变模型，并予以不同浓度（25、50、100 μg/mL）SFPS进行干预。Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡，MTT比色法检测细胞增殖活力，测定细胞内过氧化产物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。 结果 SFPS可抑制PA对L02细胞增殖活性的下降和凋亡率的上升，降低MDA含量，升高SOD水平，不同浓度组间比较差异有统计学意义且具有剂量依赖性。 结论 L02细胞脂肪变性时发生明显的氧化应激，羊栖菜多糖能在一定程度上减轻氧化损伤、抗细胞凋亡。

[关键词] 羊栖菜多糖；氧化应激；脂肪肝；软脂酸

[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0017-03

The occurrence of oxidative stress in L02 fatty model and the intervention of sargassum fusiforme polysaccharide

WU Limin XIA Shenglong SHEN Sujian XIA Xuanping XUE Zhanxiong JIANG Yi

Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To establish a model of fatty degeneration in human normal liver cell line（L02） and to investigate the effect of palmitate（PA） on oxidative stress in hepatocytes and the effect of SFPS on the redox system of fatty liver cells. Methods L02 cells were induced by 0.5 mmol/L PA to establish a model of fatty degeneration， and were treated with different concentrations of SFPS（25， 50， 100 μg/mL）. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC labeling method. Cell proliferation activity was measured by MTT colorimetric assay. Intracellular peroxide products including malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） were measured. Results SFPS could inhibit the decrease of proliferation activity and apoptosis rate of L02 cells， decrease the content of MDA and increase the level of SOD， and the difference was statistically significant among different concentration groups and dose-dependent. Conclusions The oxidative stress occurs in the fatty degeneration of L02 cells. Sargassum fusiforme polysaccharide can alleviate oxidative damage and resist apoptosis to a certain extent.

[Key words] Sargassum fusiforme polysaccharide； Oxidative stress； Fatty liver； Palmitic acid非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病机制及病理基础尚不完全明确，其中“二次打击”[1]被认为是目前最为成熟的解释发病机制的学说。氧化应激对于NAFLD的发生发展起着关键作用[2，3]。近几年，有报道称羊栖菜多糖（sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）经证实有抗凋亡[4]、抗氧化[5，6]、抗肿瘤[7，8]、抗肝纤维化[9，10]等多种生物活性。本研究主要观察羊栖菜多糖在软脂酸（palmitic acid，PA）所致肝细胞脂肪变模型中的干预作用，从而为中药防治NAFLD提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

正常人肝细胞株L02。

1.2 实验材料

羊栖菜多糖（SFPS）由温州医科大学实验室制备。Dispase购自日本Sanko公司，MTT粉购自美国Sigma公司，软脂酸（PA）购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术研究所，优级胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Abcam公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自北京索来宝生物公司，MDA和SOD检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。endprint

1.3 L02细胞脂肪变模型的建立和分组

在超净工作台、无菌条件下，采用贴壁法培养L02，将细胞分为五组，分别是对照组、PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组。对照组：加入细胞培养液。PA模型组：培养24 h后，给予0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-L组：25 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-M组：50 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-H组：100 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。随后测定相应的指标。

1.4 MTT法检测细胞增殖活力

按上述分组，96孔板常规培养，每组6个复孔。终止培养前4 h每孔加入10 μL MTT，培养结束时弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，微孔板震荡仪振荡10 min，应用酶标仪调至490 nm波长测各组OD值。以对照组A值为对照，计算PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞存活率。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集各组细胞，细胞用PBS洗涤2次。重悬细胞，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光常温孵育5 min，流式细胞仪分析测得数据。

1.6 过氧化产物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平的测定

按以上分组处理后，收集培养板上的细胞和培养液，按照MDA和SOD检测试剂盒的标准操作流程，分别检测MDA含量、SOD水平。细胞分组培养6个复孔，取其均值。

1.7 统计学方法

采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测L02细胞的增殖活力

以不同浓度的SFPS预处理及PA孵育L02细胞后，MTT法检测各组细胞的增殖活力。肝细胞脂肪变性以0.5 mmol/L的PA作用L02细胞48 h为模型，细胞存活率为（64.7±2.5）%。在浓度25～100 μg/mL时，羊栖菜多糖可增强脂肪变肝细胞的增殖活性，差异有统计学意义（F=4.02，P<0.05）。SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞存活率分别升高至（70.0±3.0）%、（75.5±3.3）%、（84.1±3.7）%。

2.2 SFPS对细胞凋亡率的影响

对照组的细胞凋亡率为（5.1±2.0）%，而PA模型组L02细胞的凋亡率为（39.8±4.7）%。SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞凋亡率分别为（36.2±4.9）%、（27.8±2.9）%、（16.9±3.1）%，均显著降低（F=3.95，P<0.05）。说明通过羊栖菜多糖的预处理可抑制脂肪变细胞凋亡，且有剂量依赖性（图1）。

2.3 SFPS对PA所致L02细胞氧化损伤的影响

PA模型组上清液SOD活性明显低于对照组，预先加入不同浓度SFPS可增加SOD活性，其中50、100 μg/mL浓度组与模型组比较有显著性差异。PA模型组细胞MDA含量明显高于对照组，预先加入不同浓度SFPS各组MDA的含量下降，25、50、100 μg/mL浓度组与PA模型组比较均有显著性差异（P<0.05）。见表1。

表1 SFPS对PA所致L02氧化损伤的保护作用（x±s，n=6）

注：#P<0.05，##P<0.01 vs对照组；*P<0.05，**P<0.01 vs PA模型组。各处理组细胞的SOD活力（F=3.74，P<0.05）和MDA含量（F=3.38，P<0.05）總体均数不全相等

3讨论

NAFLD的病理机制表明氧化应激在其发展早期可能已存在损伤。细胞通过呼吸利用氧产生ATP时，氧自由基或ROS的产生超过细胞的清除解毒能力，细胞的氧化与抗氧化失调产生大量的氧化中间产物造成组织、细胞损伤的状态称为氧化应激[11]。大量研究证据表明超量脂肪酸导致线粒体氧化超负荷，ROS和RNS生成过多而蓄积[12]，导致脂质过氧化产物和细胞因子的释放，介导NAFLD的发生发展[13]。

不同性质的脂肪酸均可导致L02细胞发生以甘油三酯升高为特征的脂肪变性，对细胞有一定的毒性作用，但是饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸更易造成细胞损害，它的脂毒性更强。通常无论是正常人还是NAFLD患者，体内的软脂酸都是含量最多的一种饱和脂肪酸[14]。故本研究选用软脂酸诱导L02构建肝细胞脂肪变模型。结果显示PA模型组L02细胞增殖活性显著降低，凋亡率增加，MDA含量升高，SOD水平降低，说明随着细胞内脂肪酸的沉积，引起氧化应激和脂质过氧化，导致细胞抗氧化因子过量消耗和抗氧化酶活力衰竭。

降低氧化应激损伤、保护受损的肝细胞、减少肝细胞凋亡是治疗NAFLD 的一个重要途径。羊栖菜多糖是一种水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖胶和褐藻淀粉的形式存在，为非细胞毒性物质，具有天然、安全、有效的特点，故其已引起人们的普遍关注。已有实验证明，SFPS具有清除自由基、提高抗氧化酶活性及抑制脂质过氧化的作用[15，16]。陈慧玲等[17]发现SFPS可剂量依赖性地抑制H2O2所致血管内皮细胞存活率的降低，阻止LDH外漏，增加NO释放，并减少MDA生成，提高SOD活性。倪小芬等[18]报道SFPS可对抗H2O2诱导的胰岛β细胞的凋亡，增加抗氧化酶活性。王贞丽等[19]研究发现SFPS对氧化应激人成纤维细胞有保护作用。本实验发现给予25 μg/mL SFPS处理后，脂肪变肝细胞的MDA含量降低，细胞增殖活性增加，细胞凋亡率降低。当给予的SFPS浓度增大到50 μg/mL、100 μg/mL时，细胞增殖活性增加及细胞凋亡率降低的效应更加明显，MDA含量逐渐降低，SOD水平逐渐升高，说明SFPS能减轻PA引起的肝细胞氧化损伤，且保护作用在一定范围内具有剂量效应关系。endprint

此外，羊栖菜多糖抗细胞凋亡的作用可能通过Bcl-2家族调节的线粒体通路进行。该家族中的Bax及Bcl-2能够正负调控凋亡过程，在一定条件下形成同二聚体及异二聚体导致线粒体的外膜通透性改变，决定了细胞的生存与死亡。当Bax的量相对增高时，则Bax同二聚体增多，促进细胞凋亡。而Bcl-2的量相对增高时，Bcl-2同二聚体增多，形成Bcl-2-Bax异二聚体，两者均能抑制细胞凋亡。文献报道[20]，羊栖菜多糖能够降低肝细胞株脂肪变模型中的Bax基因的表达，增加Bcl-2基因的表达，使两者比值发生改变，从而发挥抗细胞凋亡作用。

综上所述，本研究通过软脂酸建立人正常肝细胞株脂肪变模型，观察羊栖菜多糖对氧化应激损伤肝细胞的干预作用，结果发现羊栖菜多糖能在一定程度上减轻氧化应激、抗细胞凋亡，但其具体作用机制仍需进一步研究证实。

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（收稿日期：2017-08-15）endprint