男性不育患者Y染色体AZF区微缺失的临床研究

陈俊丰+殷玮琪+王恺赟+马超+王力+马琪

[摘要] 目的 探讨男性不育患者Y染色体微缺失检测的临床意义。 方法 应用PCR多重技术对293例无精子和严重少弱精子的不育患者（非梗阻性无精子症159例、严重少弱精子症134例）Y染色体上AZFa、AZFb和AZFc 3个区域进行微缺失检测。 结果 在293例患者中，共检出31例患者AZF区域微缺失，缺失率为10.58%；其中，非梗阻性无精症23例，严重少弱精症8例。上述患者中，4例位于AZFb区，5例位于AZFb+AZFc区，20例位于AZFc区，2例被检出AZFc+AZFb+AZFa区域三重缺失。 结论 Y染色体AZF区微缺失是引起男性不育的重要原因之一，无精子症和严重少弱精子症不育患者有必要进行Y染色体微缺失检查，便于早期诊断和治疗。

[关键词] Y染色体；AZF微缺失；男性不育；无精子症；弱精子症

[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0007-03

Clinical study on microdeletion of AZF regions of Y chromosome in male infertile patients

CHEN Junfeng1，2 YIN Weiqi2 WANG Kaiyun1，2 MA Chao3 WANG Li3 MA Qi1，2

1.Translational Research Laboratory for Urology， Ningbo Key Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 2.Department of Urology， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 3.Andrology Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of Y chromosome microdeletion in male infertile patients. Methods PCR multiple technique was applied to perform microdeletion detection in the three regions of AZFa， AZFb and AZFc on the Y chromosome in a total of 293 infertile patients with azoospermia and oligoasthenospermatism（non-obstructive azoospermia in 159 cases and severe oligoasthenospermatism in 134 cases）. Results Among 293 patients， a total of 31 patients had microdeletion of AZF region， with the deletion rate of 10.58%； among them， non-obstructive azoospermia was in 23 cases， and severe oligospermia was in 8 cases. Of the above patients， 4 patients were located in the AZFb region， 5 were located in AZFb+AZFc region， and 20 were located in AZFc region. AZFc+AZFb+AZFa region triple deletion was detected in 2 cases. Conclusion The microdeletion of Y chromosome in AZF region is one of the important causes of male infertility. For the infertile patients with azoospermia and severe oligoasthenospermatism， there was a need to carry out Y chromosome microdeletion examination， which is easy to perform early diagnosis and treatment.

[Key words] Y chromosome； AZF microdeletion； Male infertility； Azoospermia； Asthenospermia

全球有10%～15%的育齡夫妇受困于不育，其中男性因素超过一半[1-2]。引起男性不育的因素很多，而无精子症和严重少精子症是男性不育中常见的病因[3]。造成非梗阻性无精子症和严重少精子症最常见遗传学病因是精子发生基因的异常。Y染色体长臂11间隔存在控制精子发生的基因为无精子症因子（azoospermic factor，AZF），AZF发生的区域主要有4 个：AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd，这其中以AZFc 的缺失最多见，AZFb 的缺失次之，AZFa、AZFd 区少见[4-5]。这些区域任意1个位点的微缺失可导致精子发生障碍，临床上可表现为男性无精子症或严重少弱精子症，因此对AZF的研究备受关注。本文利用两组多重PCR技术对293例无精子症和严重少弱精子症患者外周血进行Y染色体AZF区微缺失检测，探讨在男性不育患者中Y染色体微缺失检测的临床意义。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

筛选2012年11月～2015年4月在宁波市第一医院泌尿外科就诊的男性不育患者293例，年龄20～50岁，平均（27.64±4.57）岁，均有不育史，其中非梗阻性无精子症159例，严重少弱精子症134例。精液分析及无精子症、严重少精子症的诊断均按照WHO第5 版《人类精液检查与处理实验室手册》要求进行[6]，即连续3次精液检查并经离心沉淀检测均无精子者为无精子症，3次精子浓度均<5.0×106个/mL者为少弱精子症。此外，本研究选取40例健康生育男性作为阳性对照，和10例女性作为阴性对照，以此监测样本是否污染。

1.2 研究方法

Y染色体微缺失检测：本研究参照欧洲男科学会和欧洲分子遗传质量网联合推荐的体系及位点，即在每个AZF区域使用2个序列标签位点：SY84（AZFa）、SY86（AZFa）、SY127（AZFb）、SY134（AZFb）、SY254（AZFc）、SY255（AZFc）。利用这6个序列标签位点通过两套多重聚合酶链反应（PCR）扩增：Ⅰ组为SY254、SY86、SY127，Ⅱ组为SY255、SY84、SY134。

本研究直接用外周血作為底物扩增，改良强力多重PCR技术体系，PCR反应体系为20 μL，反应缓冲液包括60 mM Ttricine，5 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L Mgcl2，6%甘油，PH8.7，全血2.5 μL，dNTP 2 μL，1 μL突变型Tag酶，0.1～0.2 μM各引物浓度。PCR循环条件为：95℃初始预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火90 s，72℃延伸60 s，35个反应循环后72℃延伸15 min，4℃保存样品。Y染色体性别决定基因SRY为内控对照，已育健康男性的DNA作为阳性对照，正常女性DNA作为阴性对照，灭菌蒸馏水作为空白对照。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳电压120 V，电泳时间90 min，通过凝胶成像仪观察分析。

2 结果

2.1 无精子症和严重少弱精子症患者中Y染色体缺失率情况

293名无精子症和严重少弱精子症患者中，31例发生AZF微缺失，总缺失率为10.58%。无精子症159例中23例缺失，缺失率为14.47%；严重少弱精子症134例中8例缺失，缺失率为5.97%；40例正常男性对照未发现缺失位点。

2.2 AZF不同区域的缺失率情况

31例AZF微缺失患者中，无精子症23例，严重少弱精子症8例。AZFb区域缺失4例，占1.37%；AZFc区域缺失20例，占6.82%；AZFb+AZFc区缺失5例，占1.71%；AZFa+AZFb+AZFc区缺失2例，占0.68%。在31例男性AZF缺失患者中无精子症患者发生的缺失率明显高于严重少弱精子症患者。无精子症和严重少弱精子症患者各区域缺失具体情况见表1。封三图1A为正常男性Y染色体微缺失检测阴性结果电泳图，封三图1B为Y染色体AZFc区域微缺失检测结果的电泳图。

3 讨论

引起男性不育有多种原因，其中无精子症和严重少弱精子症是影响男性不育的重要遗传因素。Y染色体AZF区微缺失是导致精子发生障碍的重要原因之一，通过微缺失筛选可以避免一些不必要的药物和手术治疗。由于地区、民族、纳入研究样本的标准及选择AZF区序列标签位点的数量及位置差异，AZF微缺失发生率在无精子症和严重少弱精子症患者中也不尽一致。有研究表明AZF微缺失发生率在无精子症和严重少弱精子症患者中，分别为10%～15%和5%～10%[7]。韩瑞钰等[8]报道1875例不育患者中，Y染色体微缺失率为11.6%，其中无精子症缺失率为18.4%，少弱精子症缺失率为4.8%，重度少精子症缺失率为4.8%。Ambulkar等[9]报道在印度156名男性不育患者中，Y染色体缺失率达8.83%，其中在61名无精子症患者中有8例Y染色体缺失，缺失率达13.1%，在严重少弱精子症患者中Y染色体缺失率为5.3%。Naasse等[10]研究显示，573名摩洛哥无精子症和少精子症患者中，有60例Y染色体微缺失，缺失率为10.5%，其中无精子症和重度少精子症患者中的缺失率分别为13.06%和1.55%。本研究显示，Y染色体微缺失发生率在无精子症患者中为14.47%，少弱精子症患者中为5.97%，总缺失率为10.58%，与国内外报道相近。

Y染色体长臂AZF区，主要由四个相互独立的区域AZFa、AZFb、AZFc和A ZFd组成，各个区域的缺失引起的临床表型不同[11]。AZFa的缺失非常罕见，仅占男性不育Y染色体微缺失中的3%左右，整个区域缺失多表现为唯支持细胞综合征，为原发性无精子症[12-13]。AZFb缺失区域的患者，占男性不育Y染色体微缺失中的15%左右，生殖细胞成熟障碍，生精过程阻滞在初级精母细胞阶段，睾丸内可见精原细胞和初级精母细胞，但无精子生成[13-14]。AZFa与AZFb区缺失的不育患者，即使睾丸穿刺也无法获取精子，也不能做卵母细胞质内单精子注射，只能通过他人供精的方式生育后代。AZFc区域缺失最常见，占男性不育Y染色体微缺失中的60%左右，临床表现多样化，从轻度弱精子症到无精子症[13，15]。目前普遍认为，AZFc区域缺失的患者，尚存生成精子的能力，因此，可以通过辅助生殖技术生育自己的后代。AZFd缺失的患者，一般表现为中轻度少精症，有些甚至是拥有正常的精子数，但精子的形态却畸形。目前尚无文献报道该区域独立缺失的情况存在，其常同其他区域联合缺失[16-17]。韩瑞钰等[8]报道1875例不育患者中，217名患者Y染色体微缺失，Y染色体微缺失率为11.6%，AZFa区缺失8例，占3.7%；AZF b区缺失9例，占4.2%；AZFc区缺失122例，占56.2%，AZFb+AZFc区缺失46例，占21.2%，AZFa+AZFb+AZFc区缺失32例，占14.7%。Asadi等[18]研究报道1885名伊朗无精子症和少精子症患者中，有99例Y染色体微缺失，缺失率为5.2%。在这99例微缺失患者中，AZFc区域缺失患者为70例，缺失率高达70.7%，AZFb+AZFc缺失率为18.1%，AZFb缺失率为5.0%，AZFa与AZFa+AZFb+AZFc区缺失率均为3%。Kim等[19]报道，在1306例韩国男性不育患者中，有101例Y染色体微缺失，其中AZFc区域缺失率为53.5%，AZFb+AZFc缺失率为24.7%，AZFa+AZFb+AZFc缺失率为8.9%。一项对中国男性不育患者Y染色体微缺失的多中心研究显示，在1808例不育患者中，发现有150例（8.3%）Y染色体微缺失，在这些微缺失患者中，有2例在AZFa区缺失，3例在AZFb区缺失，35例在AZFc区缺失，AZFb+AZFc与AZFa+AZFb+AZFc联合缺失各有3例[20]。本研究尚未发现单纯AZFa和AZFd区缺失患者，可能与这些缺失类型比较少见、收集样本量较少有关。本文AZFb区域缺失4例，占12.9%，AZFc区域缺失20例，占64.52%，AZFb+AZFc区缺失5例，占16.13%，AZFa+AZFb+AZFc区缺失2例，占6.45%。我们报道的AZF各位点微缺失发生率与国内外报道有相同的趋势。endprint

本研究表明非梗阻性无精子症和严重少精子症患者与Y染色体微缺失密切相关。Y染色体微缺失在辅助生殖中可垂直传递给后代，导致子代不育。因此为了减少这种遗传病的发生，在辅助生殖前进行Y染色体微缺失检测具有重要的临床意义。

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（收稿日期：2017-09-25）endprint