正交试验优选土茯苓提取液的澄清工艺

王冬梅，朱 伟，袁小红，卢传坚*

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广州 510120；2. 广东省中医药科学院，广州 510006；3.广州中医药大学博士后科研流动站，广州 510405）

土茯苓为百合科植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb.)的干燥根茎，性味甘平，具有解毒，除湿等功效，药典记载用于湿热淋浊，痈肿瘰疬，疥癣等[1]。土茯苓是皮肤科临床内外治法的常用中药，尤其适用于岭南地区的顽固、复发性皮肤病，如银屑病等[2-7]，近年来课题组对土茯苓进行了系列研究[8-11]。落新妇苷是药典中土茯苓的指标成分，黄杞苷也是其含量较大的活性成分[12]。中药提取液传统多采用水提醇沉法进行澄清，醇沉需耗费大量酒精，在除杂同时，极易造成有效成分丢失[13]。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂是天然高分子化合物，能选择性地除去药液中的蛋白质、鞣质等无需成分，提高有效成分的含量[14-15]。为更好地去除土茯苓提取液中的杂质，同时最大程度保留药材的指标成分，实验采用正交试验设计Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂对土茯苓提取液的澄清工艺进行研究。

1 实验材料

Waters600E分析半制备高效液相色谱仪，包括 600四元梯度泵、2998 Photodide Arryay Detector、717 plus Autosample 和 Empower 工作站；Inertsil ODS-3色谱柱（北京迪马）；Rotavapor R-215减压旋转蒸发仪（瑞士Buchi），TC-15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；MaxQ8000摇床（美国赛默飞） ；PHS-3C酸度计（上海精科）；U2901紫外双光束分光光度计（日本日立）；EPOCH 超微量微孔板分光光度计（广东云星科学仪器）；BS 224 S万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统）；XMTD-8222电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备)；超声波清洁器（上海波龙电子）；B600A医用离心机(安新县白洋离心机厂)；Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂（天津振天成科技，批号120726）；Milli-Q超纯水(美国密理博)；色谱甲醇（瑞典欧普森）；甲酸（天津科密欧）；落新妇苷标准品（成都普瑞科技，批号：A100526）；黄杞苷（中国食品药品检定研究院，批号111906-201102）；土茯苓药材购自康美药业（批号110908801），经广东省中医院袁小红主任中药师鉴定为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 30% A→55% A，10～30 min 55% A→70% A，平衡时间15 min），流速0.8 mL/min，柱温24 ℃，PDA检测器采集范围：190～400 nm，检测波长290 nm。

2.2 供试品提取 取土茯苓饮片950 g置圆底烧瓶中，加入9 L体积分数为60%的乙醇，加热回流3次，每次2 h，将醇提液混合，用纱布滤过，减压回收乙醇，得250 mL粗提液，加去离子水定容至1 000 mL备用（即每毫升药液含0.95 g原药）。

2.3 对照品溶液制备 精密称取黄杞苷和落新妇苷对照品各2 mg，分别加2 mL甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL，再用甲醇稀释成不同浓度倍数。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取上述不同浓度的两种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10 μL，以测得的响应信号（峰面积）和浓度进行线性回归，得到落新妇苷的回归方程：Y=37 844X+140 634（R=0.999 7），在3.13～200 μg/mL浓度线性良好。黄杞苷回归方程：Y=18 372X+23 279（R = 0.999 9），在1.56～50 μg/mL浓度范围线性良好。

2.5 系统适用性实验 分别精密吸取两种对照品与供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，HPLC色谱图见图1A、1B。

2.6 精密度实验 取同一份对照品溶液连续进样6次，测定两种对照品成分的峰面积，计算RSD。落新妇苷和黄杞苷RSD分别为1.4%和0.6%，表明仪器精密度良好。

图1 A 落新妇苷和黄杞苷标准品（1.落新妇苷2.黄杞苷）

图1 B 土茯苓提取液（1.落新妇苷2.黄杞苷）

2.7 稳定性实验 取同一份供试品溶液分别于样品制备后的0、3、6、12、18、24、48 h进样，测定峰面积，计算RSD。结果处方中两成分峰面积的RSD分别为1.8%和1.2%，表明48 h内供试品溶液稳定性良好。

2.8 加样回收率实验 按2.2方法制备的供试品溶液1 mL，平行6份，分别按样品-对照品（1:1）的比例加入一定量的混合对照品溶液，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果显示，落新妇苷和黄杞苷对照品的加样回收率分别为102.6%和101.1%，RSD分别为1.4%和0.6%，表明此方法的准确度较好。

2.9 澄清剂工艺考察

2.9.1 澄清剂的配制 Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂由A，B两组分组成。A组分：精密量取1.0 g A组分中加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100 mL的黏胶液，溶胀24 h，用双层纱布过滤即得。B组分：精密量取1.0 g B组分中加入少量体积分数为1%的醋酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1%的醋酸溶液配制成100 mL的黏胶液，溶胀24 h，用双层纱布过滤，保存备用。

2.9.2 澄清剂A、B加入顺序对除杂效果的影响 根据说明书，Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂主要是根据溶液的性质选择不同的添加顺序，待实验处理的土茯苓提取液pH值为2.79，相对于蛋白质等电点（pH值4.8）为酸性环境，其添加顺序为先A后B组分，且先后加入的组分用量比为2:1。因此，确定澄清剂的加入顺序为先A后B，A组分用量为B组分2倍。

2.9.3 评价指标 用澄清剂对土茯苓提取液进行澄清处理时，既需最大限度的减少目标有效成分的损失，又要保证较好的澄清效果。分别选取落新妇苷含量保留率（X1）、黄杞苷含量保留率（X2）、固形物去除率（X3）作为评价指标进行综合评分，将落新妇苷保留率X1和黄杞苷保留率的权重定为0.7，固形物去除率X2权重定为0.3，即OD% =（0.7X1+0.7X2）/2+0.3X2。计算公式：落新妇苷保留率=澄清后提取液落新妇苷的含量/土茯苓提取液中落新妇苷的含量×100%；黄杞苷保留率=澄清后提取液黄杞苷的含量/土茯苓提取液中黄杞苷的含量×100%；固形物去除率=（澄清前固形物含量-澄清后固形物含量）/澄清前固形物含量×100%。

2.9.4 正交试验 根据单因素试验结果和相关文献，设计正交试验。以澄清剂加入量，料液比，温度，时间为考察因素，各选取最佳的3水平，以L9（34）正交表进行试验，按照“2.9.3”项的方法，计算落新妇苷和黄杞苷保留率及固形物去除率，进行方差分析。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

表2 正交试验方差分析表

2.9.5 验证试验 由正交试验结果得出，澄清剂加入量A组分为2%，B组分为1%，料液比为1:10，温度为60 ℃，反应时间1 h，为Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂对土茯苓提取液最佳工艺条件，按照“2.3”项的方法，平行3次，计算落新妇苷和黄杞苷保留率及固形物去除率。

2.9.6 醇沉对照试验 量取料液比为1:10的土茯苓提取液 20.0 mL于250 mL锥形瓶中，缓慢加入4倍量无水乙醇，不断混匀，密封，放入4 ℃冷库静置24 h，倾出上清液，离心，浓缩至10 mL，加去离子水定容至20 mL即为醇沉后的土茯苓提取液。按照上述条件及方法，计算落新妇苷和黄杞苷保留率及固形物去除率。

3 结果

3.1 正交试验结果 由L9（34）正交试验结果的极差R可以看出，4因素对指标成分落新妇苷和黄杞苷保留率的影响顺序为：料液比＞澄清剂＞时间＞温度；4因素对固形物去除率的影响顺序为：温度＞时间＞料液比＞澄清剂；料液比对综合评分影响最大。由L9（34）正交试验结果(见表2）的方差分析可以看出，澄清剂加入量及提取液料液比对综合评分有显著影响，温度和时间对提取液的澄清效果无统计学意义。

温度和反应时间对落新妇苷和黄杞苷保留率无显著性影响，而澄清剂又对固形物清除率有显著影响。试验中发现，澄清剂A成分为2%时的土茯苓提取液澄清效果好，从正交实验结果和节约时间、成本方面考虑，确定Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂澄清土茯苓提取液的最佳工艺条件为澄清剂加入量A组分2%，B组分为1% 料液比为1:10，温度为60 ℃，反应时间1 h。

3.2 验证试验结果 见表3。

表3 验证试验结果

3.3 醇沉法成分保留率和固形物去除率 由表3看出，天然澄清剂组落新妇苷和黄杞苷保留率分别为98.71%和98.46%，比醇沉组保留更大比例的落新妇苷和黄杞苷，醇沉组固形物去除37.5%，是澄清组的两倍多，天然澄清剂对土茯苓提取液的澄清在除杂的同时，保留更大比例的活性成分，用量少且节省时间，比传统的醇沉法更有优势。

4 讨论

本实验在建立HPLC方法测定供试品提取液中落新妇苷和黄杞苷含量的波长选择上，据落新妇苷最大吸收波长为290.4 nm，黄杞苷为292.8 nm，两者波长比较相近，因此检测波长选择290 nm。

实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流动相系统，结果以甲醇-0.1%甲酸水为流动相时显示基线平稳，且落新妇苷及黄杞苷分离效果好，故选择甲醇-0.1%甲酸水为流动相系统。

课题组前期以多糖保留率和蛋白清除率为指标，考察天然澄清剂纯化土茯苓多糖研究中显示80 ℃时，料液比1:15，提取2 h，A组分2%，B组分1%，多糖纯化效果最好[16]。多糖为水溶性的极性大分子，析出需要相对较高的温度且耗时略长，且易混入杂蛋白[9,17-20]。本实验采用4因素3水平正交试验优化ZTC1+1Ⅱ型天然澄清剂对土茯苓提取液的澄清工艺，更以HPLC法精确显示土茯苓指标成分落新妇苷和黄杞苷澄清前后的含量变化，结果显示，在最大保留落新妇苷和黄杞苷成分的同时，有效去除了蛋白、鞣酸等杂质。同传统醇沉法相比，节约大量乙醇试剂，不仅效率高且重要成分损失少。

综上，本实验以正交试验研究Ⅱ型 ZTC1+1天然澄清剂对土茯苓提取液的最佳工艺，实验结果表明优化后工艺安全稳定、简单省时。

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