不同中医证型中溃疡性结肠炎患者外周血清IL-6和IL-23表达研究

曹 蛟，刘文奇，李 舒，杨晓航*

（1.陕西中医药大学医学技术学院，咸阳 712046 ；2.武汉大学基础医学院，武汉 430072 ）

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病中的一种，其病因不明确，主要与遗传因素、免疫因素和环境因素有关，病变为浅表性和非特异性炎症，乙状结肠受累最明显[1]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-23（interleukin-23，IL-23）是一些疾病炎症反应中重要的细胞因子[2]。Allocca[3]认为IL-6与IBD以及其他慢性炎症性疾病和癌症发生发展密切相关的重要细胞因子。IL-23在UC的发生、发展中具有非常重要的作用，它主要由活化的单核巨噬细胞和B细胞产生。能促进T细胞、抗原提呈细胞产生 IFN-γ和IL-12 ，与炎症反应疾病密切相关[4]。近年来，有学者发现IL-6 和 IL-23 在黏膜表达水平可反映 UC 疾病活动度[5]。

虚实辨证是中医八纲辨证的重要内容，也是中医临床以“病位”和“病性”确立证候分类的基本原则。因此阐明疾病虚实证候形成的物质基础和发病的分子病理机制，对于中医证候本质研究、 疾病临床治疗具有重要意义。本实验旨在研究IL-6和IL-23分别在UC不同中医证型患者中的差异，为中医虚实辨证UC提供物质基础，同时也为临床治疗提供依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2013年1月－2014年12月在陕西中医学院附属医院住院治疗的UC患者31例，健康对照组6例。参照《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》[6]中的标准将患者分为湿热内蕴证7例，年龄（47.5±24.5）岁，男5例，女2例；脾胃气虚证14例，年龄（48±23）岁，男9例，女6例；脾虚湿热证10例，年龄（49.5±13.5）岁，男4例，女6例。另设立健康对照组6例，年龄（31±7）岁，男5例，女1例。经统计分析，各组性别、年龄构成无明显差异（P＞0.05）。

纳入临床采集受试者入选标准：1）符合UC的西医诊断标准；2）符合中医脾胃气虚证、湿热内蕴证和脾虚湿热证诊断标准；3）年龄在18～55岁之间；4）近一个月内无肠道感染疾病；5）近一个月内未使用抗生素及益生菌制剂；6）患者自愿签署知情同意书；7）采样过程符合伦理委员会要求。

排除标准：1）UC的其他中医证候者；2）合并有代谢性疾病，如糖尿病、高血脂、高血压、肥胖、代谢综合征等；3）有严重的并发症，如局部狭窄、肠梗阻、肠穿孔、中毒性结肠扩张、结肠癌、直肠癌及肛门疾病者；4）妊娠及哺乳期妇女；5）过敏体质及对多种药物过敏者；6）合并肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重原发病及精神病患者；7）病情危重，研究者判断无法坚持中医治疗者。

试剂及仪器：IL-6、IL-23检测ELISA试剂盒购自美国Immunoway公司；美国BioTek 公司ELx808酶标仪；科大创新有限公司KDC-40低速离心机。

1.2 方法

1.2.1 病例收集 根据《溃疡性结肠炎临床诊断指南》[7]标准，收集UC病例，并进行临床调查。患者阅读签定知情同意书，确定入选排除标准，填写基本信息、中医症状评分表、既往史、治疗史、合并疾病和用药情况。对入选患者做相关检查，对安全指标进行评估。参照《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》[6]将入选的31例患者进行辨证分型，其过程由专人（附属医院两位主治医师）进行质控和辨证分型。另入选健康成人6例作为对照组。

1.2.2 IL-6、IL-23检测 采集患者清晨空腹肘静脉血约5 mL，室温静置10 min，3 000 r/min离心10 min。小心抽取血清后立即冻存于-80℃冰箱，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，分别测定IL-6和IL-23水平。1.2.3 实验步骤 1）稀释标准品从2000 pg/mL到0 pg/mL放入特定的离心管中。充分混匀几次或者轻轻振荡。向96孔板中每孔加入100 uL的已经稀释好的标准品，室温孵育2 h。样本按照顺序用Assay Dliuent加以稀释，稀释到可以检测的浓度范围。然后每孔加入100 uL。2）检测抗体加入已包被的一抗吸出标准品稀释液，每孔加入300～400 uL 1×wash bu f fer，振荡冲洗3～4次。将稀释detection antibody solution检测抗体溶液（1:200稀释）；Assay diluent，至浓度为0.4 ug/mL，充分混匀。每孔加入100 uL已经稀释过的detection antibody solution。密封96孔板，室温孵育2 h。3）链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合的生物素标记的检测抗体。①将detection antibody solution吸出96孔板，洗板4次；②用Assay diluent将400×的streptavidin-HRP稀释，按照1:400的比例，稀释成1×的streptavidin-HRP solution。每孔加入100 uL室温孵育30 min。4）液体底物显色反应的应用，吸出1×streptavidin-HRP solution，板洗4次。每孔加入100 uL的ready –to –use substrate（底物）室温孵育直至变色,避光。变色过程终止，迅速每孔加入100 uL的终止液，30 min后移至酶标仪检测吸光度，波长范围在540 nm-570 nm之间。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，多组样本均数之间比较，采用单因素方差分析，实验数据以均数±标准差（x± s ）表示。以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 在31例UC患者中，IL-6表达水平对照组与脾胃气虚组比较P＜0.05。而对照组、湿热内蕴组、脾虚湿热组之间比较均无显著差异P＞0.05。IL-23表达水平对照组与湿热内蕴组、脾胃气虚组、脾虚湿热组之间比较P＜0.01。湿热内蕴组与脾胃气虚、脾虚湿热组比较P＜0.05，有统计学意义；脾胃气虚组与脾虚湿热组之间比较P＞0.05，两者之间无差异性，无统计学意义，（见表1）。

表1 31例不同中医证型UC患者外周血清IL-6和IL-23表达情况（x±s）

2.2 在UC患者中，3种中医证候中IL-6和IL-23表达水平均高于对照组。同一种细胞因子中，不同中医证候之间白介素表达水平不同。不同细胞因子中，脾胃气虚组表达水平最高，其次是脾虚湿热组和湿热内蕴组（见图1所示）。

图1 31例不同中医证型UC患者外周血清IL-6和IL-23表达情况（均值）

3 讨论

炎性细胞因子在肠炎发病过程中扮演着重要的角色，现在实验研究发现，白介素在UC的发病中关系尤为密切，可作为判断UC治疗和预后的生物指标之一[8]。Gerlach[9]认为IL-9参与调节肠道屏障功能，改变肠道的渗透性。IL-23能促进Th17细胞分泌促炎性细胞因子IL-17，参与多种慢性炎症性疾病，而IL-17在UC肠道黏膜上的高表达与疾病的活动指数呈正相关[10]。Geremia A[11]研究表明，IL-23也作用于固有免疫系统，有助于炎性细胞因子的产生和组织炎症细胞。有学者对UC患者血清与健康血清IL-23水平进行分析比较，发现IL-23对溃疡性结肠炎的发病机制中起重要作用[12]。Mirsattari D[13]表明血清IL-23表达水平与溃疡性结肠炎的持续时间和严重程度是直接相关的。而Taka B[14]研究发现IL-6 与炎性细胞信号通路关系密切。IL-6可直接抑制炎性细胞凋亡，促进炎性细胞过度分泌[15]。王少鑫等[16]表明IL-6表达失衡与UC的病情进展相关。周勇[17]亦表明IL-1β、IL-6、IL-8的表达水平可直接反映出UC患者的病情程度。因此,大量的国内外文献表明溃疡性结肠炎的发病及严重程度与白介素表达水平密不可分。

不同中医证候虚实之间，白介素的表达水平亦有差异。殷银霞等[18]在对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠血清及组织中的表达中发现，脾肾阳虚型的大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的表达水平较空白组明显升高。杨立春等[19]对临床180例UC患者研究发现，实证患者血清中IL-6、IL-8表达水平比虚证、虚实夹杂证高；UC患者活动期IL- 6、IL-8水平较缓解期高，这对中医辨证分型有一定的参考价值。李丽萍[20]对临床196例UC患者研究发现，虚证患者的IL-4表达水平明显低于实证患者。刘红芬等[21]对77例活动期不同中医证型UC患者中发现实证患者IFN-γ表达水平显著高于虚证患者，而IL-4表达水平确显著低于虚证患者。本实验研究发现，IL-23表达水平中，对照组与湿热内蕴组、脾胃气虚组、脾虚湿热组之间比较P＜0.01。湿热内蕴组与脾胃气虚、脾虚湿热组比较P＜0.05。脾胃气虚组与脾虚湿热组之间比较P＞0.05。IL-6表达水平对照组与脾胃气虚组比较P＜0.05。而对照组、湿热内蕴组、脾虚湿热组之间比较差异无统计学意义P＞0.05，但这并不能说明湿热内蕴组和脾虚湿热组中IL-6的表达水平与UC无关。可能与各样本数量、性别及年龄比例等因素有关。另外对IL- 6和IL-23表达水平和各证候进行分别比较发现，脾胃气虚组的白介素表达水平最高，其次是脾虚湿热组和湿热内蕴组。这可对UC的临床辨证分型中有一定的参考价值。

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