miR-126抑制非小细胞肺癌细胞系A549细胞的增殖、转移和侵袭

王晓娟 答邦明 丁亚文 冯 刚

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院肿瘤科，湖北 武汉 430033)

非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌类型的80%〔1〕。NSCLC的治疗策略包括放疗、化疗及与最新发展的细胞治疗、免疫疗法和靶向药物治疗相结合。新的诊疗方法提高了NSCLC患者的生存率。但目前早期诊断的NSCLC患者5年生存率为40%～67%，进展期NSCLC患者中位生存期仅有2年〔2〕。多种肿瘤抑制基因的失活或某些致癌基因的超表达在肺癌发生发展中起重要调控作用，本研究初步探讨微小RNA分子(miR)-126在体外对NSCLC细胞系A549细胞增殖、转移和侵袭性的影响。

1 材料与方法

1.1实验细胞 正常肺上皮细胞系16-HBE细胞和肺癌细胞系A549细胞购于 American Type Culture Collection(ATCC)，培养于37℃含5% CO2的培养箱中，培养基为含10%胎牛血清的 DMEM 完全培养基，每3 d换液1次。

1.2主要试剂和仪器 TRIzol购自Invitrogen公司，DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco公司，MTT试剂盒购于sigma公司，逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR Supermix购于全式金公司。miR-126 mimic、inhibitor及其阴性对照购于广州锐博。

1.3实验方法

1.3.1实时定量PCR 通过TRIzol提取细胞总RNA，20 ng总RNA逆转录用来合成cDNA。2.5 μl cDNA、1 μl miR-126特异性引物与SYBR Green qPCR Supermix混合后进行实时定量PCR测定。以小RNA分子U6为内参定量miR-126浓度。

1.3.2细胞活性检测 A549细胞接种于96孔板，每孔200 μl培养基，接种3 000个细胞。细胞培养在37℃ 5%二氧化碳(CO2)培养箱24～72 h，之后每孔添加20 μl噻唑蓝(MTT)。细胞继续培养4 h。吸取培养基后，每个孔添加150 μl二甲基亚砜(DMSO)10 min，摇动培养板促进结晶溶解均匀。酶标仪下，570 nm处检测每个孔光学密度(OD)值。

1.3.3细胞划痕试验 A549细胞种于6孔板，垂直于水平轴在板底划一条直线，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次洗掉浮起的细胞。添加无血清培养基后在37℃和5% CO2培养箱培养。倒置显微镜下分别于0、24、48 h拍照。愈合率=(初始宽度-目前宽度)/初始划痕宽度×100%。

1.3.4Transwell实验 A549细胞转染后用无血清培养基制成单细胞悬液。溶解的基底膜基质(30 μl)被添加到每个Transwell上层膜上，然后将小室插入24孔板。将细胞悬液加入小室中，培养24 h后刮去膜上层细胞，结晶紫染色膜下层细胞，显微镜下拍摄计数细胞侵袭数目。

1.4统计学方法 应用SPSS18.0软件进行方差分析及q检验。

2 结 果

2.1miR-126在A549细胞中的表达 A549细胞株中miR-126水平(0.27±0.05)明显低于16-HBE细胞(1.00±0.26，P<0.01)。

2.2miR-126对A549细胞增殖能力的影响 MTT结果表明，与空白组(OD值：0.41±0.07)和对照组(0.43±0.05)相比，miR-126 mimic可明显降低A549细胞的增殖率(0.27±0.02)，miR-126 inhibitor可明显增加A549细胞的增殖率(0.61±0.08，P<0.01)。

2.3miR-126对A549细胞迁移的影响 细胞划痕试验结果显示，miR-126 mimic组划痕修复率(37.6%±6.9%)明显低于对照组(52.3%±10.2%)和空白组(55.7%±94.0%，P<0.01)。miR-126 inhibitor组(69.7%±6.2%)明显高于对照组和空白组(P<0.05)。

2.4miR-126对A549细胞侵袭性的影响 Transwell实验结果显示，miR-126 mimic组小室膜下细胞数目〔(216.5±31.2)个〕明显低于对照组〔(411.0±41.7)个、(425.1±49.5)个，P<0.01〕。miR-126 inhibitor组〔(662.4±94.3)个〕明显高于对照组和空白组(P<0.01)。

3 讨 论

mRNA长度在18～25个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(UTR)不完全配对结合对靶基因起到负调控作用。mRNA在几乎所有的生理学和病理生理学过程如细胞分化、增殖、凋亡及细胞周期中扮演一个至关重要的角色。在肿瘤中，多种mRNA表达异常，mRNA可能作为一个肿瘤抑制基因或致癌基因在肿瘤的生物学行为中起到关键调控作用〔3〕。miR-126是一个与内皮细胞功能相关的mRNA，其基因位于人类9号染色体表皮生长因子(VEGF)基因区域内〔4〕。在高度血管化的组织，包括心、肺、肝或人类脐静脉内皮细胞中miR-126呈高水平表达，促进血管生成和维护血管完整性〔5〕。miR-126在多种肿瘤组织中表达明显减少。本研究提示miR-126对肺癌的生物学行为可能有重要的调控作用。

miR-126在不同类型癌症的具体作用仍存在争议。肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭是肿瘤发展的主要几种生物学行为，是影响恶性肿瘤患者预后的重要因素，受到多种基因调控。既往研究显示，miR-126可通过下调VEGF-A的表达抑制食道癌的转移〔6〕。miR-126还可通过抑制BCL2L2促进宫颈癌细胞的凋亡〔7〕。此外，miR-126还可通过不同的靶点对肝癌、慢性淋巴癌和肾细胞癌等多种恶性肿瘤起到抑制作用〔8～10〕。本研究结果表明，miR-126可明显抑制A549细胞体外增殖、迁移和侵袭能力。

通过生物信息学手段可发现PIK3R2可能是miR-126的潜在靶基因。PIK3R2编码的蛋白质是构成磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的重要组成部分，PI3K/丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路是一个重要的转导通路，可以调节细胞增殖、凋亡和细胞周期〔11〕。既往研究显示，miR-126可以通过调控PIK3R2对滑膜成纤维细胞增殖、膀胱癌细胞增殖和转移起到调控作用〔12，13〕。miR-126可能通过靶向PIK3R2调控PI3K信号途径对A549细胞体外增殖、迁移和侵袭能力起到抑制作用。

4 参考文献

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7Wang C，Zhou B，Liu M，etal.miR-126-5p Restoration Promotes Cell Apoptosis in Cervical Cancer by Targeting Bcl2l2 〔J〕.Oncol Res，2017；25(4)：463-70.

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12Xiao J，Lin HY，Zhu YY，etal.MiR-126 regulates proliferation and invasion in the bladder cancer BLS cell line by targeting the PIK3R2-mediated PI3K/Akt signaling pathway 〔J〕.Onco Targets Ther，2016；9(42):5181-93.

13Qu Y，Wu J，Deng JX，etal.MicroRNA-126 affects rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation and apoptosis by targeting PIK3R2 and regulating PI3K-AKT signal pathway 〔J〕.Oncotarget，2016；7(45)：74217-26.