SIRT6在心血管疾病中的作用研究进展

张晓英，张致英

(西藏民族大学医学部基础医学院藏药筛选实验室，陕西 咸阳 712082)

世界卫生组织《健康统计报告2016》表明，心血管疾病死亡率居全球非传染性疾病首位，占总死亡率的46%，且有年轻化的趋势[1]。因此，积极探索心血管疾病的发病机制，关注疾病发生、发展中的“明星分子”，对于防治该类疾病意义重大。SIRT6为沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)家族重要成员，其共同特征为依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)发挥活性。早期大量的研究发现，SIRT6参与调控机体寿命与衰老、癌症、糖脂代谢、肥胖、胰岛素抵抗、炎症反应等。然而，近年来关于SIRT6在心血管疾病中的作用，及以SIRT6为靶点的药物设计日益受到重视，本文将对这方面的研究进展做一简要综述。

1 SIRT6的结构

SIRT6位于人类19号染色体的13.3端，有两个异构体，分别由8个外显子和7个外显子编码355和328个氨基酸长度的蛋白。SIRT6由高度保守的核心催化区、N端组蛋白去乙酰化酶功能区以及C端核定位信号“345PKRVKAK351”组成。SIRT6空间结构包含有1个展开的锌指蛋白结合域，而缺乏Sir2家族其他成员共有的螺旋束，其作用为连接锌指蛋白结合序列与Rossman折叠区。此外，SIRT6以单螺旋结构取代保守的、高度灵活的NAD+结合环，此结构可使其在缺乏乙酰化底物时仍能与NAD+结合，并保持较高的亲和力[2]。由于SIRT6结构有别于Sir2家族其他成员，这将为以SIRT6为靶点的药物开发带来挑战。

2 SIRT6维持端粒染色体和基因组稳定

2.1SIRT6维持端粒染色体在较早期很长一段时间内，SIRT6被认为只有ADP-核糖基转移酶活性，诱导自身ADP-核糖基化，而不发挥其他生理功能。Michishita等[3]在2008年首次发现SIRT6体内的去乙酰化酶活性：SIRT6可去乙酰化组蛋白H3K9，调节端粒染色质的功能，特异性敲除SIRT6可导致末端染色体融合及出现早期细胞衰老表型。然而，持有不同观点的学者发现，SIRT6-/-小鼠中大量的端粒功能得以保存，所以端粒缺陷并非是导致SIRT6-/-小鼠出现这些特殊表型的原因。随之，研究者对SIRT6-/-小鼠出现早衰的分子机制进行了探索，发现SIRT6通过与NF-κB相互作用，并去乙酰化其靶基因启动子上的H3K9位点，沉默NF-κB靶基因表达，从而抑制NF-κB导致的细胞衰老及凋亡。

2.2SIRT6促进基因组稳定后续的研究报道表明，SIRT6除了能去乙酰化H3K9外，还能够去乙酰化H3K56位点，并调控DNA损伤修复过程[4]。此外，SIRT6可通过碱基切除修复错配的DNA，缺失SIRT6的细胞存在较高频率的染色质异常，说明SIRT6对维持基因组的完整性和抑制细胞异常增生至关重要。

在同源重组DNA双链断裂(double-strand break, DSB)修复研究中发现，SIRT6可与DSB切除羧基末端结合蛋白(C-terminal binding protein interacting protein，CtIP)结合，并可直接去乙酰化CtIP，促进其切除。更进一步的研究发现，Lamin A在这一过程中发挥了重要作用。作为SIRT6的内源性激活物，Lamin A有助于SIRT6依赖性DNA-PK催化亚基募集到染色质，以及通过加速CtIP去乙酰化和PARP1单ADP核糖基化来应对DNA损伤[5]。

3 SIRT6在动脉粥样硬化中的作用

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一个涉及多细胞、多因子的心血管病变，其发病机制复杂，脂质代谢紊乱[6]、慢性炎症[7]、内皮损伤、氧化应激等参与其中，并可引起一系列继发性病变，如引起冠心病、脑血管病、血栓性疾病等。

3.1SIRT6对低密度脂蛋白胆固醇的作用低密度脂蛋白胆固醇是AS发展的危险因素。遗传学分析认为，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是调控低密度脂蛋白胆固醇的重要基因，其主要是通过调控低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受体的降解发挥作用[8]。而SIRT6在调节PCSK9基因表达中发挥重要作用，肝脏中敲除SIRT6可导致PCSK9基因表达，以及低密度脂蛋白胆固醇升高。进一步研究其具体机制为，SIRT6可通过叉头转录因子3(Forkhead box O3，FOXO3)被招募到PCSK9基因的近端启动子区，并可去乙酰化H3K9和H3K56，从而抑制基因表达[9]。

3.2SIRT6对内皮功能障碍引起的炎性介质的影响动脉内膜损伤是AS发生和发展的始动环节。与内皮功能障碍有关的因素包括促炎性细胞因子、黏附分子等。Lappas等[10]在人脐静脉内皮细胞的研究中发现，脂多糖可降低SIRT6的表达，敲除SIRT6可导致促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达，前列腺素、基质金属蛋白、细胞间黏附分子-1表达增加。此外，NF-κB转录活性增加。

生育期过量灌溉会引起棉花过快，中度水分胁迫会导致棉花株高过矮(图1 a)。不同灌溉量棉花各生育期株高表现均为M3W4>M3W2>M3W3>M3W1，苗期各处理株高增长较缓慢，进入蕾期后棉花生长速度明显加快，株高在6月6日至6月26日增速较大，7月6日之后株高不再增长(M3W2处理除外)。

Zhang等[11]报道，在颈动脉内膜剥脱术患者引起的AS中，SIRT6表达水平是降低的，而SIRT6杂合子敲除可增加AS的发生。由于SIRT6纯合子敲除鼠会在1个月内致死，利用SIRT6杂合子鼠与载脂蛋白E (apolipoprotein E，apoE)敲除鼠交配，得到SIRT6+/+apoE-/-和SIRT6+/-apoE-/-小鼠，研究发现，SIRT6杂合子鼠斑块发生面积增加，斑块稳定性下降，血管炎症水平增加。其具体机制为在巨噬细胞和内皮细胞中，SIRT6的下调增加NK细胞活化型配体(natural-killer group 2 member 2D，NKG2D)的表达，其介导SIRT6杂合子的促炎作用。染色质免疫共沉淀实验分析显示，SIRT6结合在NKG2D配体的启动子区，并调控H3K9和H3K56的乙酰化水平。

另有研究报道，apoE-/-小鼠敲低SIRT6可导致主动脉内皮依赖性的功能受损，主动脉窦、主动脉根部和主动脉壁斑块的体积增大，坏死核心区与巨噬细胞聚集、胶原含量降低，导致斑块易损性增强。此外，在人脐静脉内皮细胞上干扰SIRT6，可通过诱导细胞黏附分子的表达，促进单核细胞结合到内皮细胞上[12]。

综上所述，SIRT6可从抑制低密度脂蛋白胆固醇、抑制黏附分子及炎症因子表达两方面负性调控AS的发生。

4 SIRT6在心肌梗死以及缺血/再灌注损伤中的作用

急性心肌梗死仍然是全球范围内致死、致残的主要疾病之一，尽早恢复心肌血液灌注是有效的治疗手段。然而，在一定条件下，再灌注的心肌损伤反而加重，出现心肌坏死、心律失常、梗死面积扩大、内皮细胞及微血管功能障碍等，这种在缺血基础上恢复血流后，组织损伤反而加重，甚至发生不可逆损伤的现象，称为心肌缺血/再灌注损伤。心肌缺血/再灌注损伤具有多因素复杂的机制，包括自由基、钙超载、心肌纤维化、能量代谢障碍、血管内皮细胞功能紊乱、一氧化氮、中性粒细胞浸润、细胞凋亡等。

4.1SIRT6在心肌梗死中的作用Wang等[13]对371名心肌梗死病人和383名对照组人群的SIRT6基因启动子区域进行遗传学分析，共鉴定出15个DNA序列变体。在2例心肌梗死患者中鉴定了2种新型杂合性DNA序列变体，而对照组则没有发现。此外，与对照组相比，心肌梗死患者的2个单个核苷酸多态性的发生频率明显升高。由此，在心肌梗死患者中鉴定的DNA变异序列可改变SIRT6启动子的转录活性和SIRT6的水平，从而增加心肌梗死的发生率。

4.2SIRT6在缺血/再灌注损伤中的作用研究报道，SIRT6在缺血/再灌注损伤中发挥保护作用。在心肌缺血/再灌注损伤体内外模型中，SIRT6的敲除可加重心脏损伤、左心室重构、心肌细胞凋亡和功能障碍。其具体机制为SIRT6通过上调AMP/ATP激活AMPK-FoxO3a 通路，启动下游抗氧化基因如锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)的表达，从而降低氧化应激的水平，发挥其在心肌缺血中的保护作用[14]。

5 SIRT6在心肌肥大、心肌纤维化及心衰中的作用

心肌肥大是心脏在压力负荷、容量负荷以及神经体液刺激下，为保持正常泵血而做出的适应性改变。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 是哺乳动物体内重要的血压和体液调节激素，可诱导心肌细胞肥大，促进心脏成纤维细胞增殖以及心肌细胞凋亡[15]。心肌肥大早期可通过增加心输出量实现代偿，而持续的心肌肥大可导致心力衰竭。此外，心肌重塑也是心力衰竭的重要机制，由于心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，很难逆转，较早的干预和预防对于疾病的发生发展具有重要意义。

5.1SIRT6在病理性心肌肥大中的作用过表达SIRT6野生型质粒能明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，而过表达其酶活性突变体则无此效应；干扰SIRT6可诱导心肌细胞肥大反应，其机制为SIRT6可通过抑制NF-κB的转录活性而发挥作用。近期又有学者发现[16]，过表达SIRT6可对抗苯肾上腺素诱导的原代心肌细胞表面积的增大和肥大基因的表达。进一步的研究发现，SIRT6可通过抑制PI3K/Akt信号通路，促进乙酰基转移酶P300的降解，而P300水平的降低会使NF-κB p65亚基的乙酰化水平和转录活性降低，这一发现完善了SIRT6在心肌肥大中发挥保护作用的机制。

此外，笔者在研究中发现[17]，SIRT6发挥保护心肌肥大的作用与调控STAT3有关，过表达SIRT6可明显抑制苯肾上腺素诱导的肥大基因心房钠尿肽(atrial natriuretic factor， ANF)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide， BNP)的上调，同时，可下调转录因子STAT3表达水平和转录活性。随着深入研究发现，SIRT6与STAT3之间并不存在直接相互作用，其调控机制可能主要是在转录水平。

众多研究表明，内皮一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 或eNOS来源的NO的缺失可能会导致心肌肥大，而恢复eNOS活性则能纠正或减轻心肌肥大症状。进一步的研究发现[18]，过表达SIRT6能明显逆转苯肾上腺素引起的NO生成水平以及eNOS蛋白水平的下降；而干扰SIRT6则发挥相反的作用。eNOS抑制剂能阻断SIRT6对心肌细胞的保护作用，表明SIRT6对eNOS的表达和酶活性有明显的调控作用。

5.2SIRT6在心肌纤维化中的作用心肌重塑也是心力衰竭的机制之一，心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞是心肌重塑的初始事件。Tian等[19]研究发现，在AngⅡ诱导心肌纤维化体外模型和腹主动脉缩窄引起的整体动物模型中，SIRT6表达明显升高；而沉默SIRT6可促进心脏成纤维细胞增殖、细胞外基质的分泌以及肌成纤维细胞表型标志α-SMA等升高，同时NF-κB信号通路被激活，提示NF-κB通路介导了成纤维细胞的表型转化。

5.3SIRT6在心力衰竭中的作用美国芝加哥大学Sundarensan等[20]研究发现，SIRT6在心衰病人以及主动脉缩窄或者肥大激动剂异丙肾上腺素、AngⅡ刺激下，其表达明显降低。SIRT6可抑制病理性心肌肥大和心衰的发生，其机制为SIRT6与c-Jun相互作用和去乙酰化H3K9，进而抑制IGF-Akt信号通路过度激活。

6 SIRT6在缺氧性心肌病中的作用

Maksin-Matveev等[21]研究发现，在心肌缺氧条件下，SIRT6可阻碍细胞凋亡和坏死，促进细胞存活。与野生型小鼠相比，SIRT6转基因鼠乳酸脱氢酶、肌酸激酶释放明显减少。其具体机制为过表达SIRT6可激活pAMPKα通路，增加Bcl-2的表达，抑制NF-κB的激活，以及减少活性氧和p-Akt的表达。

7 SIRT6激动剂及抑制剂

基于SIRT6在心血管疾病以及早衰、糖尿病、癌症等疾病中的重要作用，关于其激动剂和抑制剂的研究也是我们关注的重点。目前，筛选SIRT6激动剂和抑制剂的研究多采用构建体外酶促反应体系进行，以同时带荧光基团和淬灭基团的多肽为底物，加入NAD+、重组SIRT6蛋白、SIRT6 Assay Buffer以及赖氨酰肽链内切酶，进行体外酶促反应，SIRT6去乙酰化底物同时，赖氨酰肽链内切酶将淬灭基团切除，底物将发出荧光。反应中加入可以激动或抑制SIRT6的化合物，可以加速或减慢这一酶促反应发生。

由于SIRT6空间结构与Sir2家族其他成员不同，因此，对于Sir2家族SIRT1起激动或抑制作用的化合物未必对SIRT6同样有效，这为SIRT6激动剂和抑制剂的研究带来困难。

7.1SIRT6激动剂的研究白藜芦醇是较公认的SIRT1的激动剂。有研究者以斑马鱼作为模式动物，探讨白藜芦醇对SIRT6是否具有激动作用。结果发现，不管用多大剂量的白藜芦醇处理多长时间，SIRT6和SIRT7均不能被激动，这可能是由于SIRT6 与SIRT1的晶体结构不同所致。随后，Cattelan等[22]发现，在缺血/再灌注损伤大鼠模型中，SIRT6蛋白表达明显降低，而白藜芦醇可使其表达得到恢复。进一步的研究结果表明，SIRT1可与核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)蛋白形成复合物，结合到SIRT6启动子上，进而调控其表达。因此，白藜芦醇并不是SIRT6的激动剂，而是通过激动SIRT1间接激动SIRT6的表达。而Ghosh等[5]发现了SIRT6内源性的激动剂Lamin A。对于SIRT6激动剂的研究较少，目前也没有发现有效的激动剂，实验研究中激动SIRT6的方法主要是通过病毒过表达或者质粒过表达实现。

7.2SIRT6抑制剂的研究Kokkonen等[23]以SIRT6特异性去乙酰化位点H3K56为底物，构建体外酶促反应体系，筛选一系列可能抑制SIRT6的化合物，结果发现，200 μmol·L-1的SIRT1选择性抑制剂EX527可使SIRT6抑制效率达到56%左右，同样剂量的槲皮素可达到52%的抑制率；而特异性SIRT1和SIRT2抑制剂Sirtinol对SIRT6活性几乎没有影响。近期学者研究发现[24]，喹唑啉二酮化合物作为新的SIRT6抑制剂可增加H3K9的乙酰化水平，减少TNF-α的表达以及增加葡萄糖的摄取。然而，现阶段对于SIRT6抑制剂的研究还不多，化合物的抑制效率也并不高，实验研究中仍采用siRNA干扰等方法抑制SIRT6的表达。

8 总结与展望

综上所述，SIRT6通过去乙酰化组蛋白H3K9或者H3K56，调控转录因子NKG2D、PCSK9，影响靶基因表达、抑制黏附因子和炎症因子表达，发挥抗AS的作用；通过上调AMP/ATP，启动下游抗氧化基因如Mn-SOD、CAT的表达，发挥其在心肌缺血中的保护作用；SIRT6还可通过抑制NF-κB、c-Jun，抑制病理性心肌肥大、心肌重塑和心力衰竭的发生；在缺氧条件下，增加Bcl-2的表达，抑制NF-κB的激活，以及减少活性氧和p-Akt的表达。

总之，SIRT6在众多心血管疾病中发挥保护作用，而以SIRT6为靶点，筛选激动剂和抑制剂的研究依然处于起步阶段。目前，商品化筛选试剂盒以SIRT6重组蛋白为底物，而不是针对其特异性的乙酰化位点，特异性不高，不同批次酶促反应的到达平台期的时间差异较大，较难控制。若研究者以SIRT6特异性乙酰化位点H3K9或H3K56设计肽链作为底物，构建合适的酶促反应体系，并结合计算机模拟化合物虚拟筛选，可以大大提高激活或抑制SIRT6化合物的研发效率，这将为心血管疾病的研究和治疗带来新的契机。

[1] World Health Organization. World health statistics 2016: monito-ring health for the SDGs[EB/OL]. [2016-10-26]. http:/ /www. who. int/gho/publications/world _ health _ statistics/2016/en/.

[2] Pan P W, Feldman J L, Devries M K, et al. Structure and biochemical functions of SIRT6[J].JBiolChem, 2011,286(16):14575-87.

[3] Michishita E, Mccord R A, Berber E, et al. SIRT6 is a histone H3 lysine 9 deacetylase that modulates telomeric chromatin[J].Nature,2008,452(7186):492-6.

[4] Yang B, Zwaans B M, Eckersdorff M, et al. The sirtuin SIRT6 deacetylates H3 K56Acinvivoto promote genomic stability[J].CellCycle,2009,8(16):2662-3.

[5] Ghosh S, Liu B, Wang Y, et al. Lamin A is an endogenous SIRT6 activator and promotes SIRT6-mediated DNA repair[J].CellRep,2015,13(7):1396-406.

[6] 刘 燕，张 军，蒲强红，等. 瑞舒伐他汀减轻ApoE-/-小鼠动脉硬化形成与ST6Gal-Ⅰ表达相关性研究[J]. 中国药理学通报,2016,32(4):525-30.

[6] Liu Y，Zhang J，Pu Q H, et al. Correlation of ST6Gal-Ⅰ expression and atherosclerotic plaque reduction induced by rosuvastatin in ApoE-/-mice[J].ChinPharmacolBull,2016,32(4):525-30.

[7] 卞 芳，金 肆. NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化相关细胞中作用的研究进展[J].中国药理学通报,2016,32(2):163-9.

[7] Bian F, Jin S. Research progress of NLRP3 inflammasome in atherosclerosis-related cells[J].ChinPharmacolBull,2016,32(2):163-9.

[8] Korman M, Wisloff T. Modelling the cost-effectiveness PCSK9 inhibitorsvs. ezetimibe through LDL-C reductions in a Norwegian setting[J].EurHeartJCardiovascPharmacother,2017, doi: 10.1093/ehjcvp/pvx010. [Epub ahead of print]

[9] Tao R, Xiong X, Depinho R A, et al. FoxO3 transcription factor and SIRT6 deacetylase regulate low density lipoprotein (LDL)-cholesterol homeostasis via control of the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (Pcsk9) gene expression[J].JBiolChem,2013,288(41):29252-9.

[10] Lappas M. Anti-inflammatory properties of sirtuin 6 in human umbilical vein endothelial cells[J].MediatorsInflamm,2012，2012:597514.

[11] Zhang Z Q, Ren S C, Tan Y, et al. Epigenetic regulation of NKG2D ligands is involved in exacerbated atherosclerosis development in SIRT6 heterozygous mice[J].SciRep,2016,6:23912.

[12] Liu Z, Wang J, Huang X, et al. Deletion of sirtuin 6 accelerates endothelial dysfunction and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J].TranslRes, 2016,172:18-29.

[13] Wang L, Ma L, Pang S, et al. Sequence variants of SIRT6 gene promoter in myocardial infarction[J].GenetTestMolBiomarkers,2016,20(4):185-90.

[14] Wang X X, Wang X L, Tong M M, et al. SIRT6 protects cardiomyocytes against ischemia/reperfusion injury by augmenting FoxO3α-dependent antioxidant defense mechanisms[J].BasicResCardiol,2016,111(2):13.

[15] 王 远，王宇光，马增春，等. 麦冬皂苷D通过降低自噬抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大[J].中国药理学通报,2016,32(10):1370-6.

[15] Wang Y，Wang Y G，Ma Z C, et al. Ophiopogonin D attenuates angiotensin Ⅱ-induced myocardial hypertrophy by reducing autophagy[J].ChinPharmacolBull,2016,32(10): 1370-6.

[16] Shen P, Feng X, Zhang X, et al. SIRT6 suppresses phenylephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy though inhibiting p300[J].JPharmacolSci,2016,132(1):31-40.

[17] Zhang X, Li W, Shen P, et al. STAT3 suppression is involved in the protective effect of SIRT6 against cardiomyocyte hypertrophy[J].JCardiovascPharmacol,2016,68(3):204-14.

[18] 黄小阳，李卓明，刘志平，等. SIRT6通过调节eNOS抑制心肌肥大的机制研究[J].中山大学学报(医学科学版),2015,36(3):338-45.

[18] Huang X Y，Li Z M, Liu Z P, et al. SIRT6 prevents phenylephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy via eNOS[J].JSunYat-senUnivMedSci,2015,36(3):338-45.

[19] Tian K, Liu Z, Wang J, et al. Sirtuin-6 inhibits cardiac fibroblasts differentiation into myofibroblasts via inactivation of nuclear factor kappa B signaling[J].TranslRes,2015,165(3):374-86.

[20] Sundaresan N R, Vasudevan P, Zhong L, et al. The sirtuin SIRT6 blocks IGF-Akt signaling and development of cardiac hypertrophy by targeting c-Jun[J].NatMed,2012,18(11):1643-50.

[21] Maksin-Matveev A, Kanfi Y, Hochhauser E, et al. Sirtuin 6 protects the heart from hypoxic damage[J].ExpCellRes,2015,330(1):81-90.

[22] Cattelan A, Ceolotto G, Bova S, et al. NAD+-dependent SIRT1 deactivation has a key role on ischemia-reperfusion-induced apoptosis[J].VasculPharmacol,2015,70:35-44.

[23] Kokkonen P, Rahnasto-Rilla M, Mellini P, et al. Studying SIRT6 regulation using H3K56 based substrate and small molecules[J].EurJPharmSci,2014,63:71-6.

[24] Sociali G, Galeno L, Parenti M D, et al. Quinazolinedione SIRT6 inhibitors sensitize cancer cells to chemotherapeutics[J].EurJMedChem,2015,102:530-9.