铁死亡的机制及其在神经疾病中的作用

姜懿纳，阳松威，张 欣，罗林明，张 钊，陈乃宏

(1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2. 北京协和医学院中国医学科学院药物研究所，北京 100050；3. 山西中医药大学中药学院，山西 太原 030619)

铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，它在形态、生物化学和基因水平上，均不同于目前已知的细胞凋亡、自噬、坏死、角化和其他形式的细胞死亡。Dixon等[1]在2012年提出，铁死亡是一种具有铁离子依赖性、氧化型的细胞死亡方式。研究发现，铁死亡在神经、肿瘤等疾病中参与疾病的发生发展，并起到重要作用。由于神经细胞具有不可再生性，损伤机制相当复杂，治疗手段十分有限，如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森综合征(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease，HD)、中风(stroke)及脑室周围白质软化症(periventricular leukomalacia，PVL)等，因此，神经疾病的诊断治疗和机制研究仍处于不断探索的状态。介于两者的机制研究发现，铁离子失衡、氧化应激和谷氨酸的异常对铁死亡和神经疾病均有重要影响。在目前已知的铁死亡机制研究中，常认为铁死亡与铁离子失衡、氧化应激和谷氨酸兴奋性毒性相关。这3点相互作用，共同促进了铁死亡的发生发展。铁死亡与神经疾病在机制上有着相似之处，目前的研究尚不深入，但铁死亡可能在神经疾病的发生发展中起到一定作用。

1 铁死亡

铁死亡是一种非典型的细胞死亡方式，与自噬、凋亡、坏死等在细胞死亡形态，以及诱发和抑制的生物学背景上有着很大的不同。在铁死亡发生的细胞内，胞质和脂质的活性氧明显增多、线粒体体积变小以及膜密度增厚。

铁死亡作为铁依赖和氧化形式的细胞死亡方式，当谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽依赖性的抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione-dependent antioxidant enzyme glutathione peroxidase 4，GPX4)在体内外抑制时，即被触发[2]。同时，铁死亡也可以由致癌RAS选择性致死(RAS selective lethal，RSL)的小分子所触发。这种小分子又可分为两类，其中“1类”铁死亡诱导剂(ferroptosis-inducing compounds，FIN)，包括Ras、ST(Erastin)和其他system xc-的抑制剂；“2类”FIN包括RSL3以及其他可能阻断谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成以抑制GPX4功能的小分子化合物[3]。来自RAS家族中的小GTP酶(HRAS、NRAS、KRAS)、Erastin和RSL3，可以促进细胞中致癌突变RAS蛋白表达，从而导致细胞死亡。

1.1铁和铁死亡作为铁依赖性的机制，铁在铁死亡中起到重要作用。如果具有生物可利用形式的铁，或铁结合的转铁蛋白生长培养基，可加速由Erastin诱导的铁死亡，而其他金属及其共轭物未出现这种现象。铁代谢功能障碍是铁死亡的诱因之一，此外，铁代谢功能障碍还能导致包括脂质过氧化产物和致死活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累[4]，在一定程度上促进了铁死亡的发生。铁螯合剂明显抑制这些反应，并且在细胞中发生膜穿透。转铁蛋白受体(transferrin receptor, TFRC)能阻滞由Erastin或Cys2剥夺引发的铁死亡。铁代谢的主要转录因子——铁反应元件结合蛋白2(iron responsive element binding protein 2, IREB2)的RNAi抑制可以抑制由Erastin触发的铁死亡，增加铁代谢相关的基因表达。与铁死亡抗性细胞相比，铁蛋白(ferritin light polypeptide-1，FTL)的表达在具有Ras突变的铁死亡敏感性细胞中明显降低，而铁死亡同时也将导致铁离子过量，引起铁摄取增加和储存减少。

1.2氧化应激与铁死亡目前研究中几乎所有铁死亡的相关机制均与ROS相关。细胞中ROS的积累是诱发铁死亡的直接原因之一。ROS的积累是由Fenton反应、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)依赖性脂质过氧化和GSH缺失引起的。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)作为脂质代谢的基因，诱发的铁死亡是由“2类”FINs(如RSL3和DPI7)所引起[5]。

虽然铁离子加速铁死亡的机制不清楚，但铁螯合剂已被证实可抑制铁离子捐赠电子到氧气以形成ROS。亲脂性铁螯合剂和去铁胺(deferoxamine，DFO)因其在铁死亡中的靶点不同而在铁螯合剂中受到关注。脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)家族作为铁依赖性的L-ROS的通道，可以抑制GSH或GPX4降解，阻断铁死亡[7]。氧化性多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)是LOX的重要组成元件，其促进PUFAs氧化成其氢过氧化物中间体，如HPETE氧化形式AA[8]。可溶性或脂质自由基的形成将导致PUFA起始断裂或扩增，ROS可通过与脂质膜中的PUFA反应，诱导脂质过氧化，同时PUFA的水平与脂质过氧化反应成反比。基于亲脂性铁螯合剂的膜渗透性和螯合铁池能相互作用，PUFA可在细胞内游离的具有“氧化还原活性”的铁池中产生，并可被亲脂性铁螯合剂抑制[6]。

与亲脂性铁螯合剂不同的是，DFO作为膜不渗透性的铁离子螯合剂，在溶酶体中螯合铁离子。由于溶酶体中的铁离子对铁死亡无直接作用，研究人员怀疑DFO是将铁离子从溶酶体转运到与L-ROS累积相关的另一位置，从而发挥作用。致死性ROS来自铁依赖性的代谢过程，它能被DFO及脂质过氧化抑制剂(包括Ferrostatin-1和Liproxstatin-1)等铁螯合剂所阻断。

核转录因子(nuclear factor erythroid 2 p45 related factor 2，Nrf2)由NFE2L2基因编码，是转录因子和亮氨酸拉链(bZIP)蛋白，能够调节人类抗氧化蛋白的表达。除了抵抗氧化应激，还有文献报道其在抗铁死亡中的作用。抗氧化蛋白和铁代谢蛋白，这些铁死亡的重要蛋白在Nrf2的蛋白上调时，可以加速转录基因编码。当Nrf2和其靶向的基因敲除时，还能促进Erastin或Sorafenib在HCC细胞中诱导的铁死亡[9]。此外，在GPX4-/-的肝脏，Nrf2基因明显上调并诱发了铁死亡。

1.3谷氨酸与铁死亡System xc-作为铁死亡抑制剂Erastin和铁死亡之间的作用通路，是一种异二聚体细胞表面的胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白，在由Erastin触发的铁死亡中受到抑制。System xc-是由特异性轻链及重链xCT(跨膜转运蛋白SLC7A11)和4F2(跨膜调节蛋白SLC3A2)组成的双链桥。在这个作用通道中，1个胞内的谷氨酸出胞，同时1个细胞外的Cys2进胞。GSH作为大脑中主要的神经递质和内源性抗氧化剂，在正常浓度范围内可以调节正常的生理功能，当其含量过高时，将导致神经兴奋毒性作用。胞外谷氨酸可以通过System xc-抑制胱氨酸摄取，一旦System xc-在体内功能失调，细胞外的谷氨酸明显增加，细胞内的GSH明显减少，将引起细胞死亡。体外System xc-的机制则可能依赖于氧化死亡(oxytosis)，也称为氧化性谷氨酸毒性，它通过促进细胞内GSH消耗，引起细胞死亡，并且导致细胞内过氧化物积累，以及激活12-脂肪氧合酶和环鸟苷酸(cGMP)依赖的钙通道。

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GPxs)是一类与系统发育相关的酶，GPX4是GPxs家族的一员。在哺乳动物中，GPX4是一种在催化中心具有硒代半胱氨酸(Sec)的硒蛋白。GPxs将GSH作为还原剂，催化H2O2和有机氢过氧化物，并还原为水和相应的醇。当GPX4的功能被抑制时，GPX4作为抗氧化酶，在细胞中能明显降低L-ROS的积累，同时cGPx4可以在诱导型cGPx4-KO小鼠中抵消12,15-LOX的活性[10]。小鼠GPX4缺失胚胎致死，但GPx其他成员并不会引起，表明GPX4除抗氧化之外，在生长过程中也起到了重要作用。化学蛋白质组学研究验证了RSL是GPX4的亲和试剂，并推测RSL3触发铁死亡可能取决于其亲和性。RSL3介导GPX4阻断剂的活性，是RSL3触发的铁死亡的原因之一[11]。然而，RSL3和其他“2类”FIN对GPX4的具体机制尚不清楚。

2 AD

AD是一种常见的神经退行性疾病，在临床上常表现为记忆认知功能障碍、语言执行能力下降等，严重影响老年人社交、生活工作。流行病学研究显示，AD在65岁以上人群中发病率高达10%以上。目前，临床上常认为AD的主要病理标志为胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积形成的老年斑、tau蛋白异常磷酸化引起的神经原纤维缠结、突触功能异常以及神经元死亡等。目前，AD确切的发病机制尚不清楚。临床上常用的胆碱酯酶抑制剂、脑血管扩张剂、情绪调节药物等只能在一定程度上减轻疾病的发生，无法从根本上逆转疾病进程。

Aβ作为AD的一个典型的病理产物，是淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)的正常的代谢产物。体内Aβ的生成与清除处于动态平衡过程，当生成增加而清除不足时，Aβ将在脑内积聚，促进AD的发病。APP基因突变会促进APP蛋白水解的β-以及γ-分泌酶增加，使得Aβ生成增加；还能促进Aβ进一步聚集成淀粉样纤维，加速AD的病理进程。APP可以调节神经元中铁离子转运通道膜铁转运蛋白(ferroportin)的水平，促进铁离子输出。当APP膜功能受损时，铁离子输出阻滞，将导致神经元内铁离子含量升高。血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin，Cp)是一种具有4个活性铜离子的多铜氧化酶，可以将铁离子从二价氧化成三价状态，同时将氧还原为水。Cp的基因突变及蛋白功能障碍是AD发病的重要诱因之一。Cp参与转铁蛋白与铁离子的结合，及其在血浆中的转运。Cp基因缺失的患者体内，中枢神经及外周铁离子紊乱[12]。

谷氨酸兴奋性毒性也是AD重要发病机制，研究显示，AD患者体内谷氨酸升高与System xc-功能异常相关，而铁死亡中谷氨酸的异常也基于System xc-功能异常[13]。此外，胰蛋白酶可结合蛋白酶激活受体2(protease-activated-receptor 2，PAR-2)，激活AD小鼠皮层神经元细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)，拮抗谷氨酸兴奋毒性。而铁离子诱导剂Erastin在肿瘤中作用于促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，给药后能够引起磷酸化的ERK1/2明显升高[14]。

此外，作为神经退行性疾病中不可忽视的诱因，氧化应激与AD、PD、HD等几种主要神经病变都有重要的联系。ROS在正常生理浓度下，能够参与调节细胞周期、吞噬作用、酶活化等几种信号通路，但是过量的ROS也将导致包括DNA、脂质和蛋白质损伤在内的损害，而这些损害是引起疾病发生发展的重要原因。不仅是AD，在PD、HD以及肿瘤和糖尿病患者体内的氧化指标较健康人群相比，都明显偏高。而铁死亡作为一种氧化型的细胞死亡方式，可能通过氧化应激过程，参与AD、PD、HD等疾病的发生发展。

3 PD

PD是中枢神经系统中常见的疾病之一，以黑质区多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征[15]。PD发展过程缓慢，发病原因复杂，常表现为静止性震颤、齿轮样肌强直、运动迟缓和姿势性反射障碍，同时也有便秘、抑郁、疼痛以及睡眠障碍等伴随症状。在中国，65岁以上人口中约有1.7%的发病率，在家族性遗传的PD研究中，发现与其相关的Parkin、α-synuclein、PINK1、DJ-1、LRRK2等十多种基因，并呈现一定的相关性。临床上常用复方左旋多巴制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂等药物，同时也可借助神经核团毁损术或脑深部电刺激手术辅助治疗。

铁死亡作为一种新的细胞死亡方式，在PD的相关研究中也有报道。临床研究表明，PD患者的黑质中的铁离子含量明显升高。而铁离子升高可以引起羟基自由基升高以及多巴胺氧化，造成一个氧化的环境，从而导致黑质中多巴胺能神经元的损伤。此外，脑部铁离子代谢相关的基因损伤也是PD的常见病因。

目前的研究表明，与铁离子摄取和转出的相关蛋白异常与PD存在着一定的联系。转铁蛋白(transferrin)作为神经系统内铁离子摄取的关键蛋白，在PD患者体内存在异常，导致神经细胞内铁离子过度摄入，从而造成了胞内铁离子聚集；而TFR2的突变则可能通过降低功能性的铁离子摄取，从而起到PD的保护作用[16]。此外还有研究表明，体内存在APP和Cp突变，也将明显增加PD的发生风险[17]。在给予PD患者去铁酮治疗后，能够明显延缓患者运动障碍，增加患者脑脊液GPxs活性，减轻患者前期至发病后18个月的运动障碍[18]。吡格列酮(glitazones)能够抑制促细胞凋亡磷脂生物合成的基因ACSL4，在与铁离子抑制剂Liproxstatin-1协同作用下，能够抑制铁死亡的发生。同时，吡格列酮在纵向研究中发现能够明显降低PD患者的发病率[19]。这些研究表明，给予PD患者铁死亡抑制剂可能是PD患者潜在的治疗手段。而基于PD患者的临床治疗，也进一步验证了铁死亡与PD的发生发展之间的潜在可能性。

根据现有研究报道，铁死亡在PD发展中的作用机制可能与多巴胺能神经细胞相关。人源的多巴胺能神经元细胞系LUHMES细胞，对铁死亡十分敏感。在给予铁死亡诱导剂Erastin后，表现出明显的铁死亡特征[20]。LUHMES细胞中Erastin和多巴胺的毒性作用能够被铁离子清除剂所阻断，不能被自噬或凋亡的阻断剂所阻断。此外，在体实验中，给予离体脑片培养Erastin，能引起纹状体神经元明显减少，铁离子阻断剂能够明显降低MPTP对脑片的损伤[21]。

4 其他神经疾病

HD临床常表现为不自主的舞蹈样动作、痴呆、情绪障碍等，是一种罕见的遗传性疾病。在HD的前期研究中，发现HD患者体内谷氨酸盐、GSH和铁离子含量异常，脂质过氧化物积累和神经细胞非凋亡性死亡[22]。在HD大鼠纹状体离体脑片模型中转染具有致病性重复的mN90Q73亨廷顿(Htt)外显子1，再给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后，能够通过抑制脂质过氧化，明显减轻离体脑片中神经细胞的死亡情况。

中风是由于血液异常流入大脑引起细胞死亡而导致的疾病，可分为缺血性中风和溢血性中风。研究发现，铁死亡也参与溢血性脑中风。体外原代细胞模型中，细胞的线粒体出现铁死亡样皱缩。Erastin引诱的铁死亡在肿瘤MAPK信号通道中，磷酸化ERK1/2在中风模型中也明显升高。在脑内由血红素引起的细胞死亡，能够被典型的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、谷胱甘肽前体N-acetylcysteine、铁离子清除剂DFO、脂质过氧化物抑制剂Trolox、ERK1/2抑制剂U0126等所阻断。

PVL是一种继发性脑白质病。缺血缺氧性的脑实质损伤，引起少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)等神经损伤，从而致使脑室周围白质软化，导致肢体瘫痪和智力低下。研究表明，OLs死亡是铁离子依赖性死亡。在PVL患者体内，脂质ROS水平也明显升高。而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能明显提高OLs在无胱氨酸条件下的细胞存活率[23]。这些研究均表明在PVL病情发展中，铁死亡可能发挥一定作用。

5 结语

细胞死亡是细胞停止执行其功能的状态，可能是老细胞的自然过程死亡和被新细胞替代的结果，或者可能由诸如疾病、局部损伤或细胞从组织脱离所引起的生物死亡。正确的细胞死亡可以维持正常的体内平衡、代谢和生理功能，反之将诱导并参与各种疾病[24]。神经疾病被认为是不可治愈的病症，其主要影响人类大脑中的神经元，导致神经结构和功能的丧失，并最终导致神经细胞的死亡。目前的研究对于神经疾病仍处于认知阶段，大部分的神经疾病作用机制仍不清楚、诊治方法仍存在缺陷。因此，对神经疾病进一步深入的机制研究，对于全面认识和治疗疾病有着重要的帮助。

铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式，通过铁离子水平升高、氧化应激和谷氨酸兴奋性毒性作用等，参与神经、肿瘤等疾病的发生发展过程。作为一种非典型细胞死亡作用方式，铁死亡参与疾病的过程，其所涉及的通道和机制在不断明确中。现有的研究表明，铁死亡抑制剂在一定程度上能够延缓疾病的进程，或减轻疾病的病情。这对于神经疾病而言，在基础的机制研究和临床应用上有着重要意义，并可能作为一个切入点，在神经疾病的预防及治疗上发挥关键作用。但铁死亡不同于其他的细胞死亡，其自身诱发及抑制的机制尚未完全阐明，在体内发生的病灶区也有待研究确认。铁死亡在疾病发生发展过程中的机制及通路，以及铁死亡抑制剂在疾病中的作用及功效，仍有待于进一步的探究。目前，在铁死亡上仍存在许多未知，这亟需大量的研究工作来探索阐明，以求对细胞死亡认知更加深入，对神经疾病的预防治疗更加全面。

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