无创产前诊断单基因遗传病的研究进展

2018-01-23史云芳张颖

天津医药 2018年12期

史云芳，张颖

单基因遗传病是由1个或1对等位基因突变引起的疾病，符合孟德尔遗传规律。虽然每种单基因病的发病率较低，但因其种类较多，总体患病率并不低。据统计，每1 000个活产儿中就有40～82人患有单基因遗传病［1］。截止到2018年6月11日，已明确发病机制的单基因遗传病有5 262种（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）。目前多数单基因遗传病尚无有效的治疗方法，致死、致畸和致残率高，给家庭和社会造成了巨大负担，因此避免此类患儿出生尤为重要。

传统的产前诊断方法是通过绒毛膜取样或羊膜腔穿刺获得胎儿样本后进行产前诊断。该方法对于孕妇及胎儿是创伤性的，有流产、死胎等风险［2-3］。妊娠妇女血浆中胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的发现［4］使无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）筛查胎儿染色体非整倍体成为可能，并已广泛用于胎儿常见染色体非整倍体的筛查。随着研究的不断深入，利用cffDNA进行无创产前诊断（non-invasive prenatal diagnosis，NIPD）单基因遗传病的研究也取得一些成果。本文主要对NIPD的研究进展及其面临的挑战做一综述。

1 NIPD常用的技术方法

目前无创产前诊断单基因遗传病的主要技术包括：（1）PCR技术，如实时PCR（Real-time PCR）、限制性内切酶PCR（PCR with restriction enzyme digest，PCR-RED）和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等。（2）环化单分子扩增和重测序技术（circulating single - molecule amplication and resequencing technology，cSMART）。（3）第二代测序（next-generation sequencing，NGS）等［5］。

1.1 PCR技术

1.1.1 Real-time PCR Real-time PCR是通过扩增胎儿通用序列，如Y染色体序列以确定胎儿性别或RHD基因确定胎儿RH血型，来诊断单基因遗传病，而不是直接检测基因突变，比如仅在男胎中确诊杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD），或仅在女胎中确诊先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH），这样避免了大约50%的有创产前诊断。在英国等国家和地区，通过cffDNA检测Y染色体已经成为严重性连锁遗传病标准产前服务的一部分，2011年英国遗传监测网批准3个实验室开展该技术用于无创产前诊断［5］。

1.1.2 PCR-RED 早期一些NIPD是应用PCRRED检测基因突变，如与软骨发育不全、致死性软骨发育不良相关的FGFR3基因突变［6］，其原理是应用限制性内切酶切断包含突变位点的DNA序列，再通过琼脂糖凝胶电泳判定结果。该方法准确，快速，费用相对低，但评价结果主观性强，大约7%～8%无肯定结论，也不适用所有突变［5-6］。除此之外，该方法1次仅能发现1个突变，适合检测已知突变。在超声结果提示胎儿异常或突变未知，尤其是多种突变引起的异常时，该方法并不适用。尽管存在这些限制，英国国民健康服务（National Health Service,NHS）于2013年仍将该技术用于无创产前诊断［2］。

1.1.3 ddPCR ddPCR是一种新型的、可对DNA或RNA进行绝对定量的检测技术，每个微滴作为一个独立的PCR反应，扩增后利用探针上的特异性荧光信号对每个微滴进行检测，最后根据泊松分布原理，计算出原始样本的浓度。该方法与Real-time PCR不同，不依靠扩增曲线进行定量，不受扩增效率影响，也不依赖复杂的生物信息学分析，在痕量样本检测等方面具有明显优势［7］。Camunas-Soler等［8］应用ddPCR技术成功无创产前诊断了9例单基因遗传病，包括血友病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷症、囊性纤维化、β-地中海贫血、甲羟戊酸激酶缺乏症、乙酰胆碱受体缺陷症和常染色体隐性遗传非综合征型耳聋，在孕11周时即可做出诊断，cffDNA比例最低仅为3.7%。Gruber等［9］应用该技术检测4对神经纤维瘤NF1突变基因和4对囊性纤维化CFTR突变基因的夫妇，研究结果显示所有母体血浆样本中都正确地确定了父源性突变基因的存在与否。该技术也被用在血友病F8和F9基因突变［10］和甲基丙二酸血症MUT基因突变［11］的无创产前诊断中。

虽然ddPCR在无创产前诊断中具有较高的敏感度和特异度，但需要针对不同家系的突变设计相应的探针，不能对所有家系设计通用的检测体系，而且cffDNA片段较短，在探针和引物设计方面难度较大。

1.2 cSMART cSMART技术是一种对血浆中游离DNA低比例突变进行定性和绝对定量的新型检测技术，可以消除潜在的PCR扩增偏倚，精确量化原始血浆样本中突变等位基因的比例［12］。该方法已经用于无创胎儿单基因遗传病的检测、肿瘤靶向用药及疗效动态监测。Lv等［12］首先应用该技术对4个威尔逊病（Wilson disease，WD）家族的ATP7B基因突变进行了无创产前诊断，结果与有创产前诊断结果一致。因为该方法只需知道父母的致病性突变，使其有望成为各种单基因遗传病NIPD的通用策略。Han等［13］也应用该方法对 80个携带GJB2或SLC26A4基因突变的常染色体隐性遗传性非综合征型耳聋家系进行无创产前诊断，与传统产前诊断方法相比，91.3%的胎儿得到正确诊断，有5例样本由于cffDNA比例低（＜6%），与传统产前诊断结果不一致；如果cffDNA比例＞6%，则该方法的敏感度和特异度达到100%和96.5%。此外苯丙酮尿症中PAH基因突变［14］也可用该方法进行检测。

1.3 NGS NGS的出现，尤其是台式测序仪的出现，使NIPD的范围逐渐扩大，从定向扩增选定基因中含有多个已知突变［6,15］，到遗传分析更为复杂的隐性遗传病［16］、X连锁遗传病［17］和母源性显性遗传病。和PCR-RED技术相比，该方法可以同时分析FGFR3基因的29个已知致病突变［6］，显著提高了检测覆盖度和敏感度，在2014年被NHS准入临床应用［2］。该方法已有广泛的验证，而检测流程仅需5 d［2,6］。

2 无创产前诊断策略

NIPD最直接的方法是在母血中检测出异常突变，已经从最初的识别父源性遗传的变异发展到用于更复杂的基因突变。

本试验考察了不同提取方式、不同提取时间以及不同提取溶剂下的样品色谱图，对比各条件下的谱图的分离情况确定供试品溶液制备条件，具体条件见“2.3”项下。

2.1 父源性常染色体显性遗传病以及新发突变 NIPD用于临床首先是针对父源性常染色体显性遗传病，即排除或识别父源性变异和检测出新发变异。在这种情况下，技术方法简单直接，因为导致突变的父源性基因并不存在于母体内，通过检测母体血浆中父源性等位基因的存在与否即可对胎儿进行诊断。隐性遗传病中父源性突变的缺失将提示胎儿为携带者或正常。2002年Gonzales-Gonzalez等［18］利用PCR和限制性内切酶分析在母体血浆中发现了一种父源性遗传的引起囊性纤维化的突变。然而，母体DNA的高背景意味着只能检测到父源性突变，无法评估胎儿是否也携带母体突变的可能性，这就需要通过有创产前诊断来确定母亲等位基因的遗传。

2.2 常染色体隐性遗传病和X连锁遗传病对于常染色体隐性遗传病和X连锁遗传病，需要确定是否有母源性突变基因的遗传。这一技术难度较高，因为母体血浆中DNA主要来源于母亲，背景高，NIPD时需要评价突变基因和野生型基因的相对数量。为了提高敏感度，目前常用的2种分析方法是相对突变剂量（relative mutation dosage，RMD）和相对单倍型剂量（relative haplotype dosage，RHDO）。

2.2.1 RMD RMD方法是根据母体血浆中突变等位基因和野生型等位基因的比例来推断确定胎儿基因型。如果为纯合子患儿，该比值会升高；如果胎儿和母亲基因型相同，即为携带者，该比值相等；如果胎儿为野生型纯合子，该比值降低［2,5］。Perlado等［19］使用RMD结合ddPCR方法计算母体血浆中cffDNA的比例，通过检查不同等位基因并计算其是否平衡来无创诊断母源性遗传的单基因遗传病。如果母体和胎儿基因型之间等位基因平衡，通过检测SRY序列（用于妊娠男胎）或通用标记RASSF1A（胎儿超甲基化，母亲去甲基化）来确认胎儿DNA的存在（用于妊娠女胎）［2］。该方法敏感度、特异度高，可以检测单核苷酸多态性（SNPs）位点和微小缺失，操作流程相对简单，但只适合检测1个已知突变，而且需要根据不同突变设计不同探针，不能检测大的结构变异和有相似序列的突变。

2.2.2 RHDO RHDO方法是通过比较母体血浆中突变基因和野生型等位基因周围SNP位点的相对量来推断胎儿单倍型。该方法将RMD方法和连锁分析结合起来，通过对一系列SNPs进行测序来实现单倍型分析。分析中包含的SNP数量越多，统计能力越强［2,5］。Parks等［17］设计靶向NGS捕获测序突变基因周围的高杂合度SNPs，构建单倍型，然后使用先证者的SNPs推断受影响的单倍型并分类母体SNPs，计算母体血浆中各单倍型的低表达或过表达，从而无创产前诊断DMD和贝氏肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）。研究发现RHDO在精确定位重组位点上是有效的，同时显示母体血浆中胎儿比例＞4%的情况下，该方法的准确度达到100%。RHDO也被用于分析CAH［20］和脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）［16］，这两种疾病的致病基因由于存在高度同源性的假基因，设计特异性检测较为困难，无法直接进行突变分析。RHDO的主要优点是分析不受突变类型的限制，适用于有假基因、大的基因缺失和致病突变位于重复区域的情况［20］，检测效率高，可以一次发现多个突变。目前其已被用于囊性纤维化的确诊，并用于临床［2,21］。RHDO方法也有一定的局限性［5］，其一是近亲结婚妊娠时，由于缺少有信息的SNPs，无法推断单倍型；其二是需要受累亲属的DNA做单倍型分类，如果没有先证者样本，检测将无法进行。

最近10×Genomics公司的linked-read测序技术解决了没有先证者而无法进行无创产前诊断这一难题。Hui等［22］直接分析父母单倍型，将父亲、母亲的完整DNA序列包裹到凝胶珠上，使DNA被片段化，并用条形码标记；经过测序后，基于条形码将DNA分子重新组装成单倍型；分析父母单倍型并确定致病基因位点附近的SNP后，用RHDO方法分析母体血浆DNA的测序数据，推测胎儿的突变状态。该方法只需要分析父母的单倍型，无需先证者样本，使其在临床上更为实用。

Vermeulen等［23］在NIPD中采用靶向位点扩增（targeted locus amplication,TLA）技术来分析父母单倍型。其原理是利用基因位点的空间接近性，交联感兴趣基因周围的序列（包含致病突变），选择性地反向PCR扩增并测序，有相同变化的被分为一个单倍型。随后，分离母体血浆中cffDNA，富集突变位点的片段并进行测序，用单倍型数据和cffDNA数据推断胎儿的遗传状态；该方法在18例妊娠妇女中得到验证，主要包括CFTR、CYP21A2和HBB基因，与有创产前诊断结果一致，在妊娠早期阶段（8周）即可做出诊断。但将这种方法用于由基因重复引起的疾病上则需要进一步优化。与linked-read测序技术相比，该方法不需要专门设备，在任何遗传学实验室都可较容易地实现，避免了测序的昂贵费用，对数据分析、存储计算要求较低。在此基础上，Vermeulen等［23］提出，需要经过大规模的临床试验，才能验证两种方法在敏感性和准确性、成本效益方面谁更优异。

3 临床应用中NIPD面临的问题

如何在临床中应用NIPD仍面临许多问题，有一些局限性需要考虑，包括实验方法的有效性，尤其涉及罕见突变，胎儿DNA的比例及样本处理流程，检测费用等，同时建立质量保证体系也很必要。

3.1 母体血浆中胎儿DNA的比例母体血浆中细胞游离DNA来源于母亲细胞和胎盘滋养层细胞的凋亡。虽然胎儿游离DNA大约占5%～10%，且随着孕周增加而增加，但其相对数量在孕期是高度变化的，影响因素包括孕周、胎盘大小、母亲是否吸烟、母亲体质量指数和母亲是否有先兆子痫等［24］。考虑到这些不可预知的因素，NIPD时测量胎儿DNA的比例是非常重要的质控参数。尤其是出现阴性结果时，有可能是胎儿DNA浓度低于检测范围［5］。

有多种方法可以测量胎儿DNA在母体血浆中的比例，包括片段大小、上下游序列、甲基化的不同、男胎出现Y染色体、显示父源性遗传的SNP等［25］。胎儿DNA的比例很难准确测定，尤其浓度低时，各方法之间也有差异。应用NIPD时测量胎儿DNA在母体血浆DNA中的比例，可以作为质控参数。

3.2 样本处理和DNA提取母体血浆细胞游离DNA是母亲DNA和胎儿DNA的混合物。当用EDTA抗凝管采集母体外周血后，母体白细胞会继续降解，使得其游离DNA比例相对增加。所以临床应用NIPD之前，需要进一步研究样本处理及其处理时间，取血后必须尽快分离血浆以维持胎儿DNA的最大比例。这点对NIPD尤为重要，因为NIPD是依赖相对突变或单倍型分析，而不是直接检测有无突变。当不能及时分离血浆时，需采用维持细胞稳定的采血管，以减少溶血，使胎儿DNA比例最大化［5］。

无论是人工还是自动提取DNA的方法，都需要经过长期评估，以优化提取方法，确保短的胎儿DNA片段能被有效提取。采用的方法很大程度上依靠样本量，优化流程后即能产生相对高质量的DNA。

临床工作中，监管样本类型和处理时间也是必须的。必须提供清晰的样本处理和运输流程，以优化下游的DNA提取和检测。

3.3 假阳性和假阴性在NIPD中可以观察到假阳性，特别在孕早期，可能是由于存在1个未被发现的双胞胎，但由于胚胎停止发育而未被发现，影响NIPD结果，可以通过超声扫描来避免此种情况的出现［2］。低比例的母体嵌合也可能导致假阳性结果，可以同时分析母体基因组DNA以避免。由于母体血浆中cffDNA浓度低，极易发生假阴性，因此Hayward等［2］建议在NIPD时同时识别父源性遗传等位基因、Y染色体序列或杂合SNPs或进行RASSF1A分析，以证明胎儿DNA的存在。

3.4 质量控制无论什么新方法应用到NIPD中，确定其准确性和可靠性是非常重要的。每次试验及临床应用时，都需要质量控制。NIPD中，质控参数包括最小测序深度和胎儿DNA比例。如果胎儿比例过小，需随着孕周增大再重复实验。为了符合医学实验室国际标准，如ISO 15189:2012，实验室需要参加室间质评（EQA），但是仍有一些特殊设计的NIPD设计较难，费用高，无法参加EQA。实验室之间样本交换可以解决这一问题，但缺乏可操作性。如果结果不满意，尚未找到有效的解决方法［5］。

3.5 费用产前分子诊断的局限性之一就是费用问题。因为父母需要早期无创产前诊断的结果，相应的实验室投入增加，所以费用也在升高。使用NGS方法或增加病例研究，可能降低费用。增加样本量也可以降低费用，但需要在选定的实验室集中测试。Verhoef等［26］研究显示，对于父源性突变或新发突变，每周无创产前诊断2～3例样本，NIPD较侵入性诊断便宜；在用RHDO方法确诊囊性纤维化等隐性遗传病或特殊设计NIPD检测方法时，费用较有创检测增加一百多英镑；假基因的存在使分析复杂并增加成本500～900英镑。而遇到罕见遗传病时开发NIPD并不合算。但随着测序成本的下降，经济形势将发生变化，NIPD的价格将变得更加低廉，更容易被接受。