Parkin共调基因调控功能与疾病研究进展

赵海洲，李 军，马延红，刘文华

(肇庆学院生命科学学院，广东 肇庆 526061)

Parkin共调基因(Parkin co-regulated gene, PACRG)于2003年被克隆、鉴定[1]。Parkin是与帕金森病(Parkinson’s disease, PD)相关的一个基因，其基因缺失或突变呈现常染色体隐性遗传的青少年型帕金森病(autosomal recessive juvenile parkinsonism, ARJP)。研究显示，Parkin基因编码的蛋白是一个E3泛素连接酶，通过泛素-蛋白酶体系统来降解异常折叠蛋白，参与氧化应激及线粒体功能调控等多种途径，发挥保护功能[2]。PACRG蛋白和α、β-tubulin相结合，促进微管成束，稳定微管结构[3]；是鞭毛、纤毛和精子尾部轴丝结构的组成部分，在鞭毛、纤毛以及精子的运动过程中起重要作用[4]；与减数分裂表达基因1蛋白(meiosis expressed gene 1, MEIG1)相互作用，与精子形成密切相关[5]；与分子伴侣热休克蛋白90、70(Hsp90、Hsp70)、T-复合物1(TCP1α、TCP1β、TCP1θ)发生相互结合，起到细胞保护作用[6]；与Parkin蛋白相互结合，对Parkin的底物类内皮素受体(Parkin associated endothelin receptor-like, Pael-R)引起的细胞损伤起保护作用[6]。

PACRG和Parkin在心、脑、骨骼肌等部位都有较高的表达，而在肺、肝等Parkin表达较低的部位，PACRG也有相对较高的表达。PACRG基因全长600 kb，以头对头的方式位于Parkin基因的反义链上，两个基因的转录起始点之间只有204 bp的长度，且共用1个双向启动子。PACRG的开放读码框编码257个氨基酸，其蛋白分子量约33 ku。蛋白序列同源性分析显示，PACRG基因编码的蛋白在物种之间具有高保守性，整个PACRG蛋白序列在人、小鼠和果蝇之间的一致性达到了29%，而蛋白羧基端的序列一致性更是达到了80%。通过蛋白序列比对和功能分析，暂还没有发现PACRG蛋白序列上存在功能域结构，但通过Propsearch分析发现，PACRG和泛素融合降解蛋白1 (ubiquitin fusion degradation protein 1)存在弱的同源性，后者是参与胞内蛋白泛素化降解的一个蛋白[1]。

近期，通过单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析对PACRG的研究结果显示，PACRG基因与癌症、肺结核、麻风病、伤寒副伤寒等疾病的发生存在相关性，但其机制还不清楚。虽然关于Parkin相关的研究已有大量文献报道，但有关PACRG的研究文献还相对较少，本文对其调控功能与相关疾病方面的研究进行综述。

1 PACRG是鞭毛、纤毛和精子尾部轴丝结构的组成部分

1.1PACRG与鞭毛、纤毛真核生物的鞭毛、纤毛轴丝微管排列是9+2式，即外圈是9组二联微管，中央一对微管。Dawe等[7]于2005年首先发现PACRG蛋白是布氏锥虫(Trypanosoma brucei)鞭毛轴丝的组成成分。敲减PACRG表达后，引起外圈二联微管1个或多个缺失，从而导致鞭毛不能正常运动，布氏锥虫生长减慢[7]。另有研究发现，PACRG蛋白除了位于轴丝的二联微管外，在衣藻的胞体、轴丝三联微管、细胞中心粒均有表达。中心粒在细胞间期作为基础体，使纤毛和鞭毛组合成核，这可能是PACRG影响纤毛和鞭毛装配的机制之一[8]。近期的研究还揭示了PACRG调控鞭毛或纤毛运动的机制，PACRG蛋白与轴丝内中心装置、径向辐条及轴丝动力蛋白发生相互作用，通过调节轴丝动力蛋白的动力臂和微管之间的滑行，从而控制鞭毛、纤毛的运动[4]。

1.2PACRG与精子Quaking (Viable) (qkv)小鼠的基因突变是由于17号染色体发生了约1 Mb的自发隐性缺失，突变鼠表现出中枢神经系统髓鞘形成障碍、震颤、雄性不育等病理症状。序列研究发现，qkv突变鼠1 Mb的缺失片段包括了qkI基因部分启动子、Parkin基因全部启动子和外显子1～5及PACRG整个基因序列，引起突变鼠的qkI蛋白表达降低，以及Parkin和PACRG表达缺失。qkv突变鼠表现出雄性不育，其精子数量少，且不能正常运动，但如果将这些精子的细胞核通过显微操作注射到小鼠卵细胞，受精卵细胞则能发育成正常小鼠。Lorenzetti等[9]采用转基因技术，在qkv突变鼠中导入PACRG编码序列，产生了qkv/qkvTg(Pacrg)转基因鼠，转基因♂小鼠产生能够正常运动的精子，并恢复了生育能力，这项结果说明PACRG蛋白是精子正常发育所必需。对人类男性不育病例的研究显示，PACRG编码区突变与男性不育没有相关性，但PACRG/Parkin基因共享启动子区域的突变与男性不育具相关性，推测可能是启动子突变引起了PACRG转录和表达水平的降低[10]。

减数分裂表达基因1蛋白对小鼠的精子发生起重要作用，MEIG1基因敲除小鼠精子尾部轴丝异常，无精子头和精子领形成，这与PACRG基因敲除小鼠(qkv)的表型相似。酵母双杂交实验证明，PACRG蛋白与MEIG1存在相互作用，MEIG1和PACRG蛋白形成复合物，MEIG1可以稳定PACRG的结构[5]。蛋白结构解析和点突变实验证明了MEIG1关键蛋白位点W50、K57、F66、Y68对于稳定MEIG1/PACRG复合物起主要作用。MEIG1/PACRG复合物对于精子尾部装配期间将货物定向到精子领至关重要，具体表现为PACRG蛋白招募MEIG1到精子领上，形成MEIG1/PACRG复合体，该复合体通过其他配合物或动力蛋白与微管相互作用，将货物(如SPAG16L等)运输至精子领，从而装配精子尾部[5]。

1.3PACRG与脑积水PACRG蛋白是小鼠室管膜细胞，以及脑室内纤毛的组成部分。qkv小鼠由于缺乏PACRG表达，会发展为获得性轻度脑积水(hydrocephalus, HC)。qkv小鼠脑室纤毛结构与野生型对照的一样，但室管膜纤毛摆动频率降低，纤毛介导的室管膜流的流速下降到野生型小鼠的32%。PACRG的瞬时表达可以使qkv突变体中的获得性轻度HC缺陷表型恢复正常[11]。

1.4PACRG与胚胎发育Thumberger等[12]的研究结果表明，在胚胎发育早期，PACRG蛋白特异性地定位表达于能够产生左向液流的表皮组织，如非洲爪蟾的原肠腔顶板、斑马鱼的库氏囊泡以及哺乳动物的后脊索。这些胚胎表皮组织带有纤毛，能产生胞外左向液流，与动物的左右不对称发育有关。非洲爪蟾敲减PACRG表达后，引起原肠腔顶板轮廓畸形，顶板表面积扩大，纤毛长度和摆动频率减小，左向液流消失，左右不对称发育的起始信号分子Pitx2c表达缺失，从而导致左右不对称发育缺陷[12]。

PACRG蛋白还参与了不依赖于纤毛的一些胚胎发育过程，包括原肠胚发育和神经管的闭合。PACRG高剂量敲低会导致原肠胚胚孔闭合失败，其机制可能是胚孔闭合依赖于瓶状细胞的顶端部位收缩，该部位收缩需要有稳定微管的支持，而PACRG蛋白可以结合并促进微管成束，稳定微管[3]。中剂量敲低PACRG可以引起神经管闭合缺陷，补回PACRG可以消除该缺陷。神经管闭合依赖神经板细胞的顶端部位收缩，该过程与原肠胚瓶状细胞的顶端部位收缩类似，也依赖于PACRG蛋白参与的微管成束和微管稳定[12]。

2 PACRG与帕金森病

PACRG和Parkin共用1个双向启动子，它们在功能上可能存在相关性。Imai等[6]研究发现，PACRG蛋白能够和Parkin，以及Pael-R共同形成包涵体，并抑制Pael-R诱导的细胞死亡，提示PACRG蛋白可能通过促进路易体的形成，对多巴胺能神经元起到保护作用。另外的研究也观察到PACRG是路易体的组成成分，只有当泛素-蛋白酶体系统受到抑制时，才能检测到内源性PACRG的表达，推测PACRG蛋白受到了该系统的降解[13]。进一步的研究显示，当蛋白酶体受到抑制后，PACRG蛋白促进蛋白聚集体的形成，增强自噬作用，对BE(2)M17细胞具有保护作用[14]。采用免疫组化方法，在PD和多系统萎缩(multiple system atrophy, MSA)患者的路易体和神经胶质细胞胞内包涵体中检测到PACRG蛋白，表明PACRG可能在PD的发生中起作用，但其机制有待深入研究[6,13]。

PACRG基因突变与早发性帕金森病(early-onset parkinsonism, EOPD)之间是否存在相关性，已有两篇文献报道。Deng等[15]研究了112例白种人EOPD患者的PACRG基因序列，发现了3个位点的单核苷酸杂合子变体，但这几个点突变不影响PACRG的RNA拼接和氨基酸序列，与EOPD之间无致病相关性。Taylor等[16]分析了76例台湾EOPD患者PACRG基因序列，发现了内含子区3个位点的单核苷酸杂合子变体，也不影响PACRG的RNA拼接和氨基酸序列，与EOPD之间不存在致病相关性。另外，该研究组还发现了3例EOPD患者出现了外显子重复或缺失的杂合子突变，他们认为PACRG外显子重复或缺失引起的单倍剂量不足可能与EOPD存在相关性[16]。

3 PACRG与麻风病

麻风病是由麻风分枝杆菌(M.leprae)引起的慢性感染性疾病，每年新增约70万人。带菌者中约10%会发展成麻风病，研究发现，免疫力低下、环境毒素、遗传基因等多因素与麻风病易感性有关。正向遗传学全基因组筛选发现，麻风病易感基因位点主要包括6p21HLA-DRB1和LTA, 6q25-q26Parkin/PACRG等。Mira等[17]对越南和巴西麻风病的单身家庭进行研究，发现Parkin/PACRG共享启动子区域17个SNP标记与麻风病存在明显关联，特别是SNP标记PARK2_e01(-2599)和rs1040079。使用多变量分析，Alter等[18]重申了Mira等关于越南人群Parkin和PACRG共享启动子区域的易感基因座的研究结果。他们还发现2个SNP，rs1333955和rs2023004与印度北部人口的麻风病易感性相关。Bakija-Konsuo等[19]对欧洲克罗地亚两个孤立岛人群麻风病遗传易感性研究，也发现Parkin/PACRG启动子区域SNP与麻风病致病呈相关性。

关于麻风病的致病机制并不十分清楚，研究表明，泛素-蛋白酶体途径参与了麻风分枝杆菌的感染过程。Parkin具有抗氧化、抗凋亡等作用，能提高宿主对麻风分枝杆菌的抵抗性。PACRG与Parkin能够共同对内质网应激引起的细胞损伤起到保护作用。而Parkin/PACRG共享启动子区的突变可能影响到这两种蛋白的表达，这些因素可能是该共享启动子区多态性位点与麻风病致病性具有相关性的原因。

4 PACRG与癌症

4.1肾透明细胞癌通过qPCR和组织微阵列免疫组化方法，Toma等[20]发现，肾透明细胞癌病人中，PACRG和Parkin的mRNA和蛋白表达水平均明显下降，mRNA和蛋白表达水平越低，病人的无病生存期和总生存期越短。其原因可能是PACRG和Parkin蛋白具有抑癌基因功能，通过泛素-蛋白酶体途径起到细胞保护作用，或是通过微管来抑制细胞增殖和细胞迁移[3, 20]。

4.2白血病Agirre等[21]检测分析了195例急性淋巴细胞性白血病患者和60例慢性粒细胞性白血病患者的骨髓样品，结果显示，在两种疾病中，Parkin/PACRG共享启动子区出现异常高甲基化的比例分别为26%和20%，异常高甲基化导致了Parkin和PACRG mRNA水平下降。文章作者认为，高甲基化引起的Parkin和PACRG蛋白表达水平下降，与血液肿瘤的发生具有相关性[21]。

4.3星形或胶质细胞瘤Ichimura等[22]采用覆盖6号染色体98.3%序列的tile path芯片技术，对104例星形细胞瘤病人的肿瘤和血液样品进行分析，发现6号染色体在星形细胞瘤中发生高频率缺失，最频繁缺失区域包括PACRG、QKI和ARID1B(AT-rich interactive domain-containing protein 1B)基因。根据研究结果，Ichimura等[22]认为，缺失区域内的PACRG、QKI、ARID1B等基因可能具有肿瘤抑制基因的功能。

5 PACRG与其他疾病

5.1肺结核Udina等[23]通过聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，对俄罗斯图瓦共和国两个地区的结核病人Parkin/PACRG共享启动子区的两个SNP位点PARK2-e01(-697)和rs1333955进行分析，结果显示，与健康人群相比，结核病患者的这两个SNP位点显示出较多的杂合子表现型，表明该标记对结核病的发病率存在影响。

5.2伤寒副伤寒Ali等[24]对印度尼西亚雅加达地区伤寒和副伤寒患者Parkin/PACRG基因簇内PARK_e01(-697)、PARK2_e01(-2599)、rs1333955和rs1040079这4个SNP位点进行分析，发现其中的PARK2_e01(-2599)位点的多态性与伤寒副伤寒致病具有相关性[24]。但该相关性要比此位点与麻风病的相关性低。

6 PACRG与信号传导

Loucks等[25]发现，PACRG蛋白定位在秀丽隐杆线虫ASE和OLQ神经元的非运动性纤毛，它影响着味觉可塑性的学习行为，即在无食物状态下，长时间暴露于化学引诱剂NaCl溶液之后，线虫会降低对NaCl的化学趋向性甚至回避，功能上与G蛋白信号传递相关。突变或过表达PACRG，会破坏秀丽隐杆线虫的味觉可塑性学习行为，这与G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCR)GPC-1(Gγ)对味觉可塑性的影响模式相一致。作者通过双突变实验发现，PACRG蛋白与GPCR亚基GPC-1(Gγ)、GPA-1(Gα)处在同一信号通路，影响味觉可塑性，而与GPCR亚基ODR-3(Gα)、GPA-11(Gα)则处在不同信号通路上，调控味觉可塑性[25]。

线虫类存在纤毛感觉灵敏度降低，伴随寿命变长的现象。对秀丽隐杆线虫的研究发现，PACRG与线虫的寿命有关。相比于野生型组，PACRG突变组秀丽隐杆线虫的寿命变短，而对PACRG突变组回复表达PACRG-GFP蛋白，可以延长线虫寿命，但PACRG此功能不依赖于GPCR。另一纤毛蛋白EFHC1和PACRG蛋白共定位于OLQ神经元，它也具有延长寿命的功能。双突变实验证明，EFHC1和PACRG处在同一信号通路，都处在促进长寿的FOXO转录因子DAF-16的上游，通过正向调控胰岛素/IGF信号途径来延长线虫寿命[25]。

7 总结与展望

自2003年PACRG基因被克隆、鉴定以来，国外、国内共有50多篇相关文献报道，这些研究主要集中于PACRG对微管功能的调节，与麻风病、肺结核、伤寒副伤寒、癌症等疾病的相关性，以及神经保护作用。其中，PACRG对微管功能的影响，参与鞭毛、纤毛轴丝，以及精子尾部的结构组成，这些方面的研究已较为深入。PACRG缺失后，致使鞭毛、纤毛、以及精子不能正常运动，从而导致胚胎发育障碍、脑积水、雄性不育等病症。PACRG和Parkin共同作用，通过增强细胞自噬等途径，对Parkin底物引起的细胞损伤具有保护作用，但其机制有待深入研究。SNP分析结果表明，PACRG与麻风病、肺结核、伤寒副伤寒等疾病具相关性，但其机制还不清楚，需要深入研究阐明。PACRG与几种癌症的发病呈相关性，PACRG基因缺失、启动子甲基化等引起的蛋白表达异常，可能是其与癌症发生相关的原因，其抑癌机制仍需进一步研究。国内有关PACRG的研究较少，Li等SNP研究结果显示，其他人种中与麻风病相关的几个位点，在中国人群中显示出非相关性。针对PACRG蛋白表达不稳定，在胞内易降解的特点，刘晙玭等运用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞系成功表达了PACRG蛋白。还有其他两篇文献报道了PACRG与精子发育及与辐射的关系。PACRG基因被克隆、鉴定以来，已发现其与胞内一些重要功能密切相关。但从其蛋白结构上也没有发现明确的功能域结构。因此，对PACRG展开深入研究，揭示其胞内调控作用机制，具有重要意义。