Wnt/Ca2+信号通路在肢体缺血/再灌注损伤机制中的研究进展

申 震,朱付平，黄 勇，范仪铭，周富强,潘成熙

(1.湖南中医药大学第一附属医院骨科，湖南 长沙 410007；2.河南省洛阳正骨医院骨科，河南 洛阳 471000)

肢体缺血/再灌注损伤(limb ischemia/reperfusion injury，LIRI)是指组织器官缺血一段时间后，重新恢复血流灌注时组织器官的损伤程度不但没有减轻反而较缺血时不断加重，机体功能进一步恶化的综合征，是一种临床上常见的多发生于严重创伤后的复杂病理过程[1]。LIRI的病理机制至今仍未完全阐明，目前医学界多认为其与脂质过氧化及氧自由基损伤、钙离子代谢紊乱、细胞凋亡、炎症反应损害等有关[2-3]。LIRI不仅可损伤局部组织，而且可以影响到远隔内脏器官。在经过肢体缺血预处理后，可以减轻远隔的心、肝、肾、脑等内脏器官的缺血/再灌注损伤程度[4-5]。如果没有及时有效地防治LIRI，肢体局部骨骼肌就会出现纤维化和挛缩等病理改变，逐渐影响肢体的正常功能，严重者导致肢体缺血性坏死面临截肢的风险，甚至引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的发生，导致多器官的功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，对患者预后及生活质量产生严重影响[6]。随着医疗技术的发展，近年来国内外专家学者对LIRI病理机制研

究及防治的重心已转移至分子机制和信号因子靶向调控方面。钙调蛋白(calmodulin，CaM)介导的Ca2+超载及机体炎症反应所导致的缺血/再灌注损伤已被医学界所公认，且Wnt/Ca2+信号通路可诱使细胞内Ca2+浓度升高，并可活化Ca2+敏感信号成分，激活三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKⅡ)以及其他转录因子，在Ca2+代谢及机体炎症反应中起着重要作用[7-8]。本文就Wnt/Ca2+信号通路在LIRI机制中所起的作用进行综述。

1 Wnt与Wnt/Ca2+信号通路

Wnt信号通路是一条繁杂的信号网络，在机体生长、发育、代谢、免疫、应激等多种生物过程中发挥着重要作用，而Wnt信号通路的调控异常与细胞凋亡、炎症及许多疾病的发生、发展、转归有着密切联系[9]。人类有19个激活不同Wnt信号通路途径，并与Wnt调节不同生物过程特异性受体结合的Wnt配体[10]，而Wnt信号通路包括经典通路和非经典通路。目前研究认为至少包括以下4条分支：① Wnt/β-catenin通路，属于Wnt的经典通路，激活Wnt/β-catenin通路可引起细胞质内的β-catenin处于稳定状态，其胞内浓度上升，信号转导因子β-catenin进入细胞核内激活靶基因，从而发挥调节作用；② Wnt/PCP通路，即平板细胞极性通路，与细胞极性密切相关；③ Wnt/Ca2+通路，主要通过诱使细胞内Ca2+浓度不断上升和Ca2+相关敏感信号传导因子活化，从而发挥调节细胞活力和细胞黏附、运动的作用；④ 调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂的胞内通路，该通路目前研究较少。

Wnt/Ca2+信号通路由Wnt配体、卷曲蛋白(frizzled protein,Fz)受体、G蛋白、散乱蛋白(dishevelled，DVL)、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)、IP3、二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、CaM、CaMKⅡ等成分构成，通路主要由Wnt5a和Wnt11激活。当Wnt信号与胞膜上Fz受体结合时，可通过活化的G蛋白和DVL激活PLC，活化的PLC可水解膜磷脂(membrane phospholipid，PIP2)，并生成IP3和DAG，IP3可促使胞内Ca2+浓度增加，DAG可激活PKC，活化的PKC可以与Ca2+各自激活CaMKⅡ促使CaMKⅡ通过自身磷酸化发挥生物学效应[11]。同时，浓度升高的Ca2+又可激活CaM，促进Ca2+与CaM形成Ca2+/CaM复合物，从而激活下游钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)。而CaN受CaM和Ca2+双重调节，活化的CaN可以使细胞内活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)去磷酸化从而被活化，活化的NFAT迁移到细胞核内并在核内聚集继而作用于下游靶分子。 简言之，Wnt/Ca2+通路以胞内Ca2+浓度升高为基点，激活PKC、CaMKⅡ、NFAT以及其他信号传导因子、转录因子，发挥调节细胞黏连和基因表达等作用。

2 Wnt/Ca2+信号通路中Ca2+、CaM及CaMKⅡ在LIRI中的作用

Ca2+是细胞内最重要的第二信使，主要由CaM控制。目前已发现的肌浆网上与钙释放、摄取、贮存有关的CaM主要有以下几种：三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)、肌浆网钙泵(sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)、兰尼啶受体(ryanodine receptor，RyR)等。IP3R、SERCA和RyR都存在3种不同的亚型，每种亚型在不同肌肉组织中表达有所不同。骨骼肌细胞肌浆网中存在IP3敏感和IP3不敏感两种钙池，胞内处于游离状态的Ca2+便储存其中，由IP3R和RyR两种系统分别控制，两者通过不同的Ca2+离子通道将钙池中的Ca2+释放到细胞质中，引起肌肉收缩。其中在骨骼肌中主要是Cav1.1型钙离子通道[12-13]。而SERCA的作用却恰恰相反，是将细胞质中的Ca2+转运回肌浆网中。机体缺血/再灌注损伤的重要环节是细胞内钙超载，已经得到大多数研究者的共识。最新研究发现，CaMKⅡ等与钙调节蛋白相关的酶是维持细胞内钙稳态的重要因素[14]，其中IP3R和内质网钙池中Ca2+转运在细胞内信号传导系统中扮演着重要角色，但当Ca2+代谢转运失调，过度激活或是过度释放Ca2+时又可诱发细胞凋亡。研究发现[15]，当机体处于缺血缺氧状态，内质网和线粒体等处钙离子通道则被激活，大量的Ca2+发生内流效应，被释放进入细胞质，继而导致Ca2+超载。细胞内Ca2+平衡状态被打破，一系列Ca2+依赖性酶促反应由于大量内流的Ca2+而被激活，从而导致细胞的凋亡。也有实验报道[16]，机体持续损伤激活CaMKⅡ信号通路，CaMKⅡ被氧化激活，促炎基因如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、补体因子B (complement factor B，CFB)的含量明显增多，产生炎症反应，而降低CaMKⅡ的活性，抑制钙超载发生机制，对重要组织器官具有保护作用。

3 Wnt/Ca2+信号通路与LIRI病理机制研究

3.1Wnt/Ca2+信号通路介导细胞内Ca2+超载机制研究当Wnt信号与胞膜上Fz受体结合后，激活胞内的G蛋白和DVL，通过活化的G蛋白和DVL激活下游的PLC，活化的PLC又可以将PIP2水解，生成第二信使IP3和DAG。IP3可扩散至内质网或肌浆网，并与内质网或肌浆网上的IP3R、RyR结合，使后者激活，导致内质网或肌浆网中Ca2+释放。此外，IP3本身作为Ca2+通道激活剂，又可使细胞膜上钙离子通道开放引起Ca2+内流。与此同时，DAG被固定于细胞膜上，激活PKC，活化的PKC一方面能增强Na+-H+的交换，迅速激活Na+-Ca2+交换蛋白增加Na+-Ca2+的交换，Na+向胞外转移的同时，Ca2+进入胞质内，使胞质Ca2+浓度上升；另一方面，又可抑制SERCA基因表达，加剧胞质内Ca2+累积。浓度上升的Ca2+，反过来又可作用于PKC使其活化。CaM是胞内Ca2+受体，可与之发生可逆性结合，当Ca2+浓度升高后，可促进与CaM相结合，使CaM构象发生变化，形成Ca2+/CaM复合物。Ca2+/CaM复合物则是一种参与多种信号转导途径的信号分子，为细胞信号传递的重要物质，既可以作用于CaMKⅡ[17]，促使CaMKⅡ与钙化的钙调蛋白(Ca2+/CaM)结合，从而导致CaMKⅡ抑制性结构域移位，发生自动磷酸化而被活化。即使当Ca2+浓度下降后，磷酸化的钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(phospho-CaMKⅡ,p-CaMKⅡ) 活性仍能保持其状态。Ca2+/CaM复合物又能使受磷蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化而活化，抑制SERCA的活性，从而导致Ca2+从肌浆网中向胞质内反向转移，加剧胞质内Ca2+累积。高浓度Ca2+降解细胞内的磷脂酶、溶酶体、蛋白酶、核酸酶等酶，对细胞的完整性造成不可逆转的损害，继而导致细胞凋亡，导致炎症损害和细胞死亡[18]。除此之外，由于Wnt/Ca2+通路介导所致Ca2+浓度升高，致使线粒体氧化磷酸化功能受损，ATP合成障碍，ATP依赖性Na+，K+-ATPases和Ca2+-ATPases被抑制，只能通过逆转Na+-Ca2+的作用机制来恢复胞质内Na+的浓度，造成恶性循环，直至诱发钙超载现象。研究证实，由此引发的钙超载在缺血/再灌注损伤中起着重要作用，且在再灌注期更为明显[18]。

3.2Wnt/Ca2+信号通路介导炎症反应机制研究炎症反应是LIRI病情发展的关键步骤。在Wnt/Ca2+信号通路中，Wnt5a可通过调控炎症因子的产生，参与炎症应答，某些炎症因子，如TNF-α也可以反过来诱导Wnt5a的表达，促进炎症进一步发展。巨噬细胞自分泌Wnt5a作用于自身，通过活化Wnt5a/Fz5-CaMKⅡ信号途径诱导分泌炎性因子IL-6、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白1β(macrophage inflammatory protein 1β，MIP-1β)等[19]。此外，Wnt5a还能够诱导环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)等其他炎症因子的表达，当敲除或阻断Wnt5a能够降低COX-2的产生[20]。Wnt5a与结构类似 G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)的受体结合，激活G蛋白，活化的G蛋白再激活下游各种效应器，使胞内Ca2+浓度上升，Ca2+继而激活PKC和CaMKⅡ。PKC激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，活化的MAPK最终使细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)或MEK(MAPK与ERK结合复合物)磷酸化，从而诱导调控TNF-α、IL[swy4]-1、IL-6、IL-8、MIP-1β、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等炎症因子；活化的CaMKII又可激活转化生长因子激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)，从而使IκB激酶( IκB kinase，IKK)活化，继而使IκB磷酸化并泛素化降解，释放核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)入核，启动炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1的转录。NF-κB作为一种快速反应因子，在LIRI的发生、发展中起着重要的作用。在骨骼肌缺血/再灌注损伤实验模型中，NF-κB表达升高，而抑制其表达能减轻炎症反应，并提高生存率，因此，适度干预NF-κB的活化有一定的临床应用价值[21]。TNF-α既能促进NF-κB表达，又依赖NF-κB反作用于下游内源性Wnt5a，促进细胞分泌Wnt5a。Wnt5a/Ca2+通路与炎症信号途径组成了繁杂的网络系统，二者联系密切又交互影响，Wnt5a/Ca2+通路的失衡会导致炎症应答的紊乱，从而诱发一系列炎性损害。

3.3Wnt/Ca2+信号通路介导细胞凋亡机制研究细胞凋亡机制参与LIRI损伤早有报道[22]，一般认为细胞凋亡是缺血/再灌注损伤诱发骨骼肌细胞死亡必然发生的过程。在LIRI损伤过程中，大量骨骼肌出现凋亡现象,而Wnt/Ca2+通路介导细胞凋亡的作用机制主要基于胞内氧自由基合成和Ca2+代谢异常。Hatoko等[23]发现，肢体在缺血6 h后，恢复血流灌注可引起腓肠肌的Bax蛋白表达升高，出现凋亡细胞。Wnt/Ca2+通路通过一系列传导激活Ca2+依赖性PKC，将PIP2水解，并激活CaMKⅡ，促使细胞内的许多生物酶降解，继而破坏细胞膜及细胞骨架，促使细胞内大量黄嘌磷脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，继而合成大量氧自由基。合成的氧自由基则继续破坏细胞膜，并引起溶酶体、线粒体等细胞器膜的破裂，进而影响细胞信号传导系统，激发Bax等调控基因，导致凋亡[24]。此外，Wnt/Ca2+信号通路所引发的钙超载现象一方面可导致细胞膜中ATP依赖性离子交换通道功能异常，导致Ca2+转出障碍，又可引起线粒体内的膜通透性转换孔开放，释放细胞色素C进入细胞质，并进一步激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶降解底物，导致凋亡。与此同时，Calpain等钙蛋白酶被激活，破坏细胞膜的结构，并在分解PIP2的过程中产生溶血磷脂，溶血磷脂进入线粒体内，导致ATP合成障碍。线粒体虽然可通过膜电位依赖性钙单向转运体摄取Ca2+，但大量Ca2+则以碳酸盐的形式沉积线粒体中，抑制其氧化磷酸化功能，加速细胞凋亡。Quindry等[25]报道，线粒体内ATP合成障碍时，Ca2+堆积升高，可诱导细胞凋亡。

4 结语及展望

综上所述，引起LIRI的机制多样且环节复杂，但Ca2+超载、炎症反应以及细胞凋亡是促使LIRI发生、发展的重要环节，而Wnt/Ca2+信号通路恰与之关系密切，在LIRI多个环节中扮演着重要角色。然而，当前Wnt/Ca2+信号通路在LIRI机制方面的研究尚不如心、脑、肝、肾等器官那样深入，仍需要广大医务工作者进行更深入的研究，进一步明确Wnt/Ca2+信号通路的组成成分及其作用机制。随着分子生物及基因工程技术的发展，相信基于Wnt/Ca2+信号通路的LIRI机制将会被进一步阐明，从而探究Wnt/Ca2+信号通路在LIRI中的作用环节，明确药物作用靶点，为防治LIRI提供新的有效的治疗方法。