儿茶素EGCG抗肿瘤及其作用机制研究进展

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(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430068)

肿瘤可发生于人体的多数器官或组织,分为良性肿瘤和恶性肿瘤,良性肿瘤生长缓慢,且可通过手术切除得到有效控制,不易复发;恶性肿瘤生长速度较快,易向其他部位浸润,对机体危害较大,切除后复发率较高,恶性肿瘤的大部分表现形式是癌症[1]。2015年,美国肿瘤协会通过对2012年全球肿瘤流行病数据的研究发现:恶性肿瘤已经成为全球的重大社会负担[2]。而在中国,2014年统计显示,约430万人被诊断为癌症,280万人因癌去世,即平均每天1.2万人患上癌症,7500人因此死亡[3]。日益增多的肿瘤发病率和死亡率使得研究者加强了对抗肿瘤药物的研究,尤其是对天然产物抗肿瘤的研究越来越深入。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中的一种天然产物,在前列腺癌细胞培养模型中显示EGCG可以降低肿瘤细胞活力并能促进多种癌细胞的凋亡,而对非癌细胞系没有影响[4]。作为一种安全性相对较高的物质,EGCG的抗肿瘤的作用和机制引起了医学及天然产物研究者的广泛关注。EGCG对肿瘤有抑制作用,其显著的抗氧化和抗炎作用很可能是其预防肿瘤的重要机制,同时,EGCG与其他物质或治疗手段的协同作用也是抗肿瘤研究的一个重大进展,本文主要从这几方面进行详细阐述。

1 EGCG对肿瘤的预防作用

1.1 抗氧化作用

1.2 抗炎作用

研究表明炎症与肿瘤的发生、生长与转移有很大的关系,特别是对一些炎症相关性肿瘤更是有显著相关性[15]。如炎症前列腺癌已被证实与炎症、微环境密切相关,EGCG因具有显著的抗炎作用而有望成为前列腺癌的化学预防剂[16]。对肺癌研究中发现对炎症反应的抑制可以限制肺癌细胞生长[17]。Toniolo等从EGCG产生过氧化氢(H2O2)的角度研究其抗炎和抗氧化作用,结果表明EGCG可以抑制转录因子(NF-κB)和环氧合酶-2(COX-2)的表达,从而产生显著的抗炎作用[18]。在多氯联苯(PCB)诱导的内皮细胞炎症模型中有类似的情况,EGCG抑制NF-κB活化而发挥抗炎作用[19]。肿瘤相关巨噬细胞对癌症的诱发有极大的作用[20],经酯化处理EGCG能够显著地抑制促炎介质一氧化氮(NO)和前列腺素(PGE2)的产生,可在巨噬细胞中发挥抗炎作用[21]。EGCG局部作用于患有牛皮癣样皮炎的小鼠,能够改善皮肤的病理状态,减轻皮肤炎症[22]。EGCG可以有效抑制炎症反应[23],对多种流行性肿瘤研究表明抑制炎症可以有效降低肿瘤的发生率[24],而EGCG优异的抗炎活性则可能是预防肿瘤的重要机制之一。

2 EGCG对肿瘤的抑制及治疗作用

2.1 抑制肿瘤相关蛋白的表达

研究表明EGCG可以通过抑制肿瘤相关蛋白的表达起到抑制肿瘤细胞生长与增殖的作用。

Notch通路是一种信号传导通路,调控着细胞的增殖、分化和凋亡,其中Notchl蛋白是Notch通路的受体,Jaggedl蛋白是Notchl的配体,欧琼等在研究中发现EGCG可以通过抑制Notchl和Jaggedl蛋白的表达进一步抑制通道的活化从而抑制鼻咽癌干细胞SPl8细胞的增殖[25]。用蛋白质印迹法(western blot)检测用EGCG处理的肝癌HepG2细胞,发现细胞内的 NF-KB P65蛋白的表达降低,同时以软琼脂集落形成实验来观察处理的HepG2细胞,细胞集落体积变小,数量减少,即EGCG可以通过调控NF-κB P65蛋白的表达来抑制肝癌HepG2细胞的增殖[26]。Smad3参与了食管鳞癌的发生发展,EGCG可以通过调控Smad3蛋白的表达来抑制食管鳞癌细胞Ec9706的增殖[27]。另外,以不同浓度EGCG对体外培养结肠癌细胞株进行实验,发现EGCG浓度在40～160 μmoL/mL均能降低p-STAT3蛋白的表达水平,抑制结肠癌细胞的增殖,且随浓度增加效果增强[28]。另外在临床研究中发现E6、E7均为高度致癌蛋白,EGCG可以促进E6、E7蛋白降解,在临床上可用于治疗人乳头瘤病毒引起的肿瘤[29]。

也有研究发现食管鳞癌细胞的产生与Her2蛋白的表达有关,其中Her2蛋白是人类表皮生长因子受体表达的产物,其在多种肿瘤组织中高度表达,可以促进肿瘤细胞的生长,不同浓度EGCG(100、200、300 mg/L)分别作用于Ec9706细胞24 h,经流式细胞术检测发现Her2蛋白显著减少(p<0.05),且癌细胞增殖指数显著降低(p<0.05),结果证明EGCG可以通过抑制Her2蛋白的表达抑制食鳞癌细胞增殖[30];除此之外,EGCG还可以通过间接作用于肿瘤相关蛋白活性作用于肿瘤,沉默信息调节因子SIRT1可以对组蛋白及多种非组蛋白产生去乙酰化修饰,调节多种肿瘤相关基因的表达和蛋白质的活性,参与肿瘤形成和发展,研究发现EGCG也可以通过抑制 SIRT1的表达,来抑制鼻咽癌细胞株C666-1的增殖[31]。

2.2 影响肿瘤细胞生长

2.2.1 调控肿瘤细胞周期 肿瘤细胞和正常的细胞一样都具有一定的生长周期,基于这一点我们可以通过调节或阻滞肿瘤细胞的周期使其停止生长和扩散。张勇等研究发现EGCG可以使肝癌细胞SK-hep1停滞于G2/M期,并且诱导肝癌细胞凋亡数增加,使治疗肿瘤成为可能[32]。以肺部长有肿瘤的A/J小鼠为实验对象,观察发现长期给予EGCG处理可以阻滞肺肿瘤细胞的细胞周期,使其停止扩散,对肺部肿瘤具有显著的治疗效果[33]。这一作用在同时使用体外与体内模型处理乳腺癌细胞的报道中也得到证实。用EGCG处理乳腺癌MDAMB231细胞,可将其细胞周期停留在G1期,且在接种乳腺癌的裸鼠体内注射EGCG可以达到相同效果,从而表明EGCG可以通过调控细胞周期达到阻止癌细胞扩散的目的[34]。还有体外实验发现EGCG可以使细胞周期停滞同时也能促进骨肉瘤(OS)细胞的凋亡,在后续临床上的实验通过检测参与肿瘤发生发展的microRNA(miR-1)水平,发现EGCG可能对骨肉瘤有治疗效果[35]。在研究EGCG对细胞周期相关蛋白的作用中,用体外培养的人的口腔鳞癌细胞株CAL-27作为对象研究EGCG对口腔鳞癌细胞增殖的影响,结果显示EGCG对大部分口腔鳞癌细胞株的增殖有抑制作用,这种抑制主要是其对信号转导通路的影响进而导致细胞周期相关蛋白表达水平的变化,导致癌细胞S期和G2/M期阻滞[36]。另外,以胆道癌细胞系TFK-1为研究对象,其与EGCG和癌细胞在一定的条件下培养72 h发现EGCG可以降低其细胞周期相关基因mRNA的表达,并且使细胞周期抑制剂p21表达增强,在胆道癌细胞系中显示出一定的抗癌作用[37]。

2.2.2 抑制肿瘤细胞端粒酶的活性 研究表明:端粒酶与大多数恶性肿瘤的发生有很大的关系[38-39],端粒酶几乎出现在所有的癌细胞中[40]。EGCG和EGC对端粒酶活性的抑制在文献中已有报道,抑制端粒酶的活性与抑制癌细胞的生长关系密切[41]。正常细胞中的端粒与细胞分裂有关,会促使DNA衰老,而癌细胞中由于端粒酶的作用使癌细胞可以无限分裂。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶功能正常表达的重要催化亚基,用EGCG处理乳腺癌MCF-7细胞会导致hTERT启动子甲基化,并可以降低组蛋白H3 Lys9乙酰化水平,从而促进乳腺癌细胞的死亡[42]。张东鹏等在研究EGCG对体外培养的人体雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的影响中发现,EGCG对其有显著的抑制作用;使用TRAP-PCR银染法检测发现,癌细胞的端粒酶活性降低,其主要是通过抑制端粒酶逆转录酶mRNA表达,从而抑制端粒酶的活性[43]。在EGCG对喉鳞状癌细胞系Hep-2细胞影响的研究中,使用EGCG处理该细胞可显著降低细胞活力、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡,且细胞内的端粒酶活性显著降低,并与EGCG浓度呈现量效关系[44]。当EGCG浓度超过200 μmoL/L时可以有效抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,进一步研究发现浓度高于12.5 μmoL/L的EGCG可以明显抑制胃癌细胞的端粒酶活性[45],同时其对肝癌的影响也是通过一定剂量的EGCG抑制癌细胞的端粒酶活性实现的[46]。

2.2.3 诱导肿瘤细胞的凋亡 在EGCG抗肿瘤研究中有一个较为明显的作用是其可以诱导肿瘤细胞的凋亡;在颈部鳞状细胞癌研究中,EGCG可以活化促凋亡蛋白NAG-1和P53,诱导肿瘤细胞凋亡[47]。Chakrabarti 等以EGCG作用于神经母细胞瘤,其可以促进肿瘤抑制基因中mir-7-1的表达,大量的mir-7-1增强了EGCG对肿瘤细胞凋亡的诱导作用[48]。EGCG还可以通过线粒体呼吸链复合物的损失,调节线粒体能量使肿瘤细胞生长产生选择性阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡[49]。β-连环蛋白的异常表达会导致多种头部和颈部癌症[50],在小鼠模型中EGCG可以有效抑制β-连环蛋白表达并由此引起头部和颈部肿瘤细胞凋亡[51]。EGCG作用于动物肿瘤模型,5 mg/mL的EGCG可以作用于凋亡分子信号Bax/Bcl-2、Caspase和细胞色素c,同时也可以作用于致癌分子信号,诱导肿瘤细胞的凋亡[52]。研究EGCG对膀胱癌的作用发现EGCG在体内和体外实验均可以诱导癌细胞sw750凋亡[53]。

2.2.4 抑制肿瘤血管的生成 肿瘤细胞的生长、侵袭与转移都与肿瘤血管的生成有很大的关系,肿瘤血管可以为细胞的活动提供养分[54],故抑制肿瘤血管的产生可以有效作用于肿瘤细胞,其中血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤血管生成的重要因子[55],可以通过调控VEGF来抑制肿瘤血管的生成,Tang等以EGCG作用于mRNA、蛋白和分泌介质等细胞,其中VEGF表达均显著减少,以此抑制血管的生成[56]。研究EGCG对肺癌A549细胞的作用主要是EGCG可以促进内皮抑制素表达,从而使VEGF表达受到抑制,使A549细胞增殖受到抑制[57]。另外陈萍等以EGCG作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞,通过与空白组对照发现,EGCG通过抑制VEGF蛋白表达抑制Hela细胞的增殖[58]。可见EGCG可以通过作用于内皮生长因子蛋白作用于肿瘤细胞。以EGCG作用于接种乳腺癌的小鼠并测定VEGF的表达水平,有EGCG作用的小鼠血管内皮生长因子表达下降,有效抑制乳腺癌细胞的活动[59-60]。用western blot法对人肝癌SMMC-7721细胞中VEGF蛋白进行检测,发现EGCG可以明显影响VEGF的蛋白表达;同时用相同的办法作用于体外建立移植瘤模型,Western-blot 检测结果显示,EGCG 仍可以抑制VEGF 的蛋白表达,即EGCG可以通过抑制VEGF蛋白表达作用于肝癌细胞[61]。

2.3 调节抑癌基因甲基化水平

肿瘤的发生与DNA甲基化有关,抑癌基因区的基因甲基化会影响其正常表达,从而丧失抑制癌症的作用[62-63]。EGCG可以降低乳腺癌细胞RASSF1A启动子的甲基化水平,使其正常表达,达到减少乳腺癌细胞系MCF-7产生的作用[64]。在研究EGCG能否通过抑制抑癌基因甲基化实现抑制黑素瘤细胞增殖的实验中,使用不同浓度的EGCG(5-30 μg/mL)处理黑素瘤A375细胞,在所使用的浓度范围内,EGCG浓度越高,对该细胞的抑制作用越显著,进一步检测发现RASSF1A甲基化状态得到逆转,从而表明抑制黑素瘤细胞的增殖与RASS1A基因甲基化的逆转有关[65]。另外,有中外研究者分别以结肠癌细胞为实验对象,研究EGCG对结肠癌细胞的作用,研究发现,当EGCG的浓度超过20 μmoL/L时就能够降低结肠腺癌细胞株COLO 320中抑癌基因P16的甲基化水平,使抑癌基因得以正常表达,从而有效作用于结肠癌细胞株[66]。另外EGCG也可以打破由RxRa启动子甲基化带来的基因沉默,使细胞中RxRa蛋白处于正常水平,能有效抑制结肠癌的发生,且不影响其他正常细胞的DNA甲基化过程,是治疗结肠癌细胞的一种可能途径[67]。

2.4 破坏肿瘤细胞的信号通路

对肿瘤信号通路的破坏也是抑制肿瘤细胞的重要途径。蒋洁琳等曾综述EGCG可以通过作用于MAPK、PI3K-AKT、NF-xB和P53等信号通路,来抑制不同肿瘤细胞的生长[68]。EGCG还可以通过破坏FAK/ERK/NFxB和AP1信号通路,使MMP9蛋白表达下降,来抑制MDAMB231乳腺癌细胞的生长和增殖[69]。EGCG也可以作用于p38和ERK通路,促进B细胞易位基因2表达,从而抑制口腔鳞癌细胞的增殖[70]。在头颈癌细胞(HNC)中EGCG可以通过抑制β-连环蛋白信号转导同时减少转录和增加泛素介导的26s蛋白酶体降解,还可以使p53通路激活,其中p53是一种关键的肿瘤抑制因子,多种机制共同作用可以有效促进HNC凋亡[71]。另有研究表明EGCG通过线粒体信号转导途径不仅降低了鼻咽癌细胞的存活率而且能诱导鼻咽癌细胞凋亡[72];这项研究也显示EGCG对线粒体信号转导通路靶标不同的干扰作用在抗癌功能中起重要作用。另有研究发现,EGCG可以在其生理相关浓度(1 μM)抑制AKT和EPK途径以抑制肝细胞生长因子诱导的肿瘤活动,促进EGCG诱导的抗侵袭作用[73]。Shankar等研究发现:EGCG可以通过作用于PI3K/Akt和ERK信号通路抑制胰腺癌细胞的生长转移[74];也可以通过作用于PI3K/Akt信号通路,引起双抑制途径PI3K/mTOR的作用,成为临床治疗癌症的候选药物[75]。

3 EGCG与其他物质或治疗手段的协同作用

EGCG可以和其他物质共同作用于肿瘤细胞,并通过不同机制显著提高其抗肿瘤活性。高峰等以结肠腺癌细胞株SW620为研究对象,用5 mmoL/L的顺铂和梯度浓度的EGCG作用于结肠腺癌细胞株,检测发现当EGCG的浓度达到100 nmol/L时,SW620细胞的增殖率由(95±5)%下降到(22±4)%,凋亡率由5%上升到57%,两者的协同作用效果较为显著[76]。视黄酸(RA)和EGCG共同作用可以显著地抑制宫颈腺癌Hela细胞的增殖并能促进Hela细胞的凋亡,作用优于EGCG单独作用[77]。在体内含有食管癌Eca-109细胞的裸鼠体内,EGCG和西妥昔单抗(Cet)的联合作用能够抑制Eca-109的增殖,诱导其凋亡,且二者表现出明显的协同作用;这种协同作用同样表现在抑制体外培养的食管癌Eca-109细胞增殖上[78]。刘申吒等比较EGCG组、放疗组以及EGCG和放疗协同作用组分别作用于人食管癌细胞株TE-1的效果,用噻唑兰(MTT)法和western blot法进行检测,发现EGCG和放射性疗法协同作用明显优于EGCG和放疗单方面的作用(p<0.01)[79]。协同作用可以通过调控肿瘤细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡从而产生作用,EGCG可以与铜离子形成络合物ECC,5-10 mg/L的ECC能使胞内活性氧的含量明显上升,使结肠癌RKO细胞周期处于G2/M期,抑制细胞的生长和增殖,从而达到抗结肠癌的作用[80]。另外还有研究发现,VEGF受体-2的选择性拮抗剂(SU5416)和EGCG共同作用可以有效地阻止肿瘤血管的生成,同时还可以引起细胞周期的停滞,促进恶性神经细胞肿瘤凋亡[81]。另有研究发现,因儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)能使EGCG快速甲基化,而使其在短期内失去活性,COMT的抑制剂恩他卡朋或托卡朋与EGCG联合作用于人肺癌H1299细胞和CL-13鼠肺癌细胞,可显著增加细胞内未甲基化的EGCG的水平,从而持续抑制肺癌细胞的活性,这种抑制作用主要是通过诱导细胞内氧化应激,细胞周期停滞以及核转录因子核易位减少来实现[82]。另外,EGCG与其他物质协同作用也可以通过破坏细胞通路途径来提高抗肿瘤作用。研究发现EGCG和5-氟尿嘧啶联合起来可以激活AMP通路,抑制PI3K/AKt通路,起到抗肝癌的作用,且二者具有协同作用[83]。总的来说,EGCG与其他物质或治疗手段的协同作用也是通过干扰肿瘤细胞的生长、调控甲基化水平、作用于信号途径等重要机制实现的,而不同作用方式的协同作用为肿瘤的治疗提供了新的思路和理论基础。

4 结论与展望

EGCG是茶叶多酚中含量最高的一种功能性成分,其可以通过抗氧化、抗炎等作用途径预防肿瘤产生;还可以通过干扰肿瘤细胞生长、抑制抑癌基因甲基化、调控肿瘤相关蛋白表达和破坏肿瘤细胞信号传导等作用途径作用于肿瘤细胞,大量的细胞实验和动物实验表明EGCG有显著的抑制、治疗肿瘤的作用。EGCG可以与其他物质或治疗手段协同作用,显著增强EGCG对肿瘤的治疗作用。

EGCG现阶段对肿瘤的治疗在临床上的应用不是很广泛,虽然在体外细胞和动物实验中越来越多的EGCG作用途径被发现,但其在人体中的作用机制还不是很清晰,有待进一步的研究。癌症纳米技术可以实现把纳米材料选择性的输送到肿瘤组织,对肿瘤细胞的作用更加高效、有目的性,因此纳米技术与EGCG的联合作用值得进行进一步研究,另外,EGCG稳定性不高是其应用受限的原因之一,对如何增加EGCG稳定性的进一步研究将提高其应用的可能性。

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