超声辅助溶剂棒微萃取-液相色谱法快速测定婴儿配方奶粉中的双酚A

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(三峡大学生物与制药学院,湖北宜昌 443002)

双酚A(Bisphenol A,BPA)作为一种重要的精细化工原料,广泛应用于食品包装材料中。据有关研究报道,BPA是一种内分泌干扰素,具有雌激素的特性,其在环境中难降解,容易蓄积在生物体内,导致生物体内分泌失调,生殖器官异常、雄体雌性化,甚至有增加乳腺癌和前列腺癌的风险[1-3]。在婴儿配方奶粉的生产过程中,挤奶装置中常用的集乳器、流量器等塑料容器和奶粉的包装材料中含有BPA[4],因此BPA由多种途径进入婴儿配方奶粉中,危害婴儿身体健康[5-6]。然而,奶粉的基质成分十分复杂且BPA含量很低,导致干扰严重,难以直接测定[7-8],分析测定之前需要对奶粉进行富集浓缩等样品前处理过程。

目前,BPA的分析方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)等[9-15]。GC-MS需要衍生化处理,过程较为繁琐。HPLC无需衍生化,且成本较HPLC-MS低,是目前应用较为广泛的检测方法。传统的样品前处理技术通常需要大量有机溶剂,且操作费时繁琐,耗费大量人力物力[16-17]。新型的绿色样品前处理技术-液相微萃取具有简单快速、溶剂用量少(微升级)、环境友好、回收率高、富集倍数高等优点[18-22]。溶剂棒微萃取(solvent bar microextraction,SBME)是Hian Kee Lee[23]提出的一种新型液相微萃取技术,将中空纤维膜(Hollow Fiber Membrane,HFM)充满有机溶剂,然后将两端密封形成溶剂棒,将其直接放进样品溶液中,搅拌萃取一定时间后,直接进仪器分析。SBME集采样、萃取和富集于一体,且HFM的使用是一次性的,可避免交叉污染。该技术有机溶剂的用量仅需几十微升,是一种绿色的样品前处理技术,已广泛应用于食品药品分析检测中[24-26]。另外,HFM微小的孔径能将奶粉中蛋白质和脂肪等大分子物质隔离在膜外,在实现浓缩富集作用的同时具有净化作用。目前尚未见SBME用于双酚A检测的报道。

本文用超声辅助溶剂棒微萃取技术,利用超声波强大的热效应、空化效应、乳化效应、强化扩散效应[27-29],加快萃取过程中的传质速度,从而提高萃取效率[30],并与高效液相色谱联用,实现婴儿配方奶粉中BPA的萃取、分离、富集和净化工作,研究建立一种婴儿配方奶粉中BPA的准确、快速、高效的绿色分析检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双酚A(Bisphenol A,BPA,99%)标准对照品 上海阿拉丁试剂公司;甲醇、乙腈 色谱级,美国Tedia 公司;正辛醇 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;婴儿配方奶粉 购于当地超市。

Agilent 1200高效液相色谱仪 配有二极管阵列检测器、Instrument化学工作站,美国安捷伦公司;Thermo Scientific BARNSTEAD EASYpure II超纯水制备仪;Sartorius ACCULAb电子分析天平 德国赛多利斯公司;ZNCL-s磁力搅拌器 河南爱博特科技有限公司;JK-100CDE超声波清洗器 合肥金尼克机械有限公司;Sartorius PB-10酸度计 德国赛多利斯公司;VP-ODS C18色谱柱(5 μm,150 mm×4.6 mm)、聚偏氟乙烯中空纤维膜(内径600 μm、壁厚200 μm、孔径0.2 μm) 天津膜天膜科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶剂棒的制备 将HFM切成一定长度的小段,放在超声波清洗器中用乙醇清洗,待自然风干后,将HFM浸泡在正辛醇中充满其表面空隙和内腔。然后用加热后的镊子将HFM两端封口,制成溶剂棒待用。

1.2.2 超声辅助溶剂棒微萃取 向装有1.0 g奶粉的萃取瓶中加入10.0 mL水溶液,手动振荡后放入超声波清洗器中,在100 W的功率和室温下进行超声萃取10 min,然后将制备好的30 mm溶剂棒和磁力搅拌子放入萃取瓶,其中给体相为pH=6的HCl溶液,受体相为0.12 mol/L的NaOH溶液。将萃取瓶放在磁力搅拌器中搅拌速度为600 r/min萃取15 min,结束后取出溶剂棒,剪开其中一端,用HPLC进样针吸出有机溶剂正辛醇,直接进HPLC分析。

萃取条件研究中,分别考察了溶剂棒的有效长度(10～50 mm)、超声时间(0～20 min)、有机溶剂种类(正辛醇、正己烷、甲苯、氯苯和三氯甲烷)、给体相组成(HCl调节样品溶液pH在2～7范围内)、受体相组成(NaOH溶液浓度在0.02～0.2 mol/L范围内)、盐效应(NaCl的含量在0～100 g/L范围内)、搅拌速度(300～900 r/min)和萃取时间(5～40 min)对BPA萃取效率的影响。

1.2.3 标准溶液的配制 甲醇溶解BPA标准对照品并定容,配制成100 mg/L的标准储备溶液,4 ℃下保存待用,所需要1～100 mg/L的标准溶液用流动相稀释后现配现用。

1.2.4 高效液相色谱条件 VP-ODS色谱柱(5 μm,150 mm×4.6 mm);检测波长280 nm;流动相:甲醇-水(70∶30,v/v);流速为1 mL/min;柱温为室温;进样量5 μL。

1.2.5 数据处理 将萃取后由HPLC获得的BPA峰面积及各因素水平导入OriginPro 8软件,制作折线图和柱状图。

2 结果与分析

2.1 超声辅助溶剂棒微萃取条件研究

2.1.1 HFM的种类选择 通常溶剂棒微萃取大多采用进口的聚丙烯HFM[31],少数选用聚偏氟乙烯HFM[32],目前,聚偏氟乙烯HFM由于制备过程简单、成本低廉,具有良好的化学稳定性、热稳定性和机械强度,已广泛应用连续膜过滤和膜生物反应器等研究领域。据研究表明,聚丙烯HFM的孔隙率为70%,而聚偏氟乙烯HFM孔隙率高达85%[33]。有机溶剂在聚偏氟乙烯HFM上的穿透速度更快、体积更大,且吸附的生物大分子物质更少,满足本实验对于膜材料参数的需求。因此,本论文采用聚偏氟乙烯HFM(内径600 μm、壁厚200 μm、孔径0.2 μm)作为溶剂棒的制备材料。

2.1.2 溶剂棒的有效长度 根据HFM的内径和长度可以粗略计算溶剂棒内萃取溶剂的体积。分别研究了溶剂棒有效长度在10～50 mm范围内对BPA的萃取效果。结果表明10～20 mm的溶剂棒所含有机溶剂的体积不够HPLC进样量的需求,而40～50 mm的溶剂棒太长,在实际萃取过程中出现变形和不稳定的情况。因此确定溶剂棒的有效长度为30 mm,此时有机溶剂的体积约为8 μL。

2.1.3 超声时间 奶粉中的脂肪和蛋白质等大分子物质会对BPA产生包裹效应。因此,在溶剂棒微萃取之前,先用超声波清洗器对奶粉溶液进行预处理,利用超声波强大的空化效应、乳化效应和强化扩散效应将BPA从奶粉基质中释放出来。同时,可以免去沉淀蛋白质和脂肪的繁琐过程。如图1所示,随着超声时间的延长,BPA萃取效率不断增大,10～20 min增幅变缓,可能在10 min以后BPA已经从奶粉基质中释放出来。超声时间太长,温度升高,会增加BPA的水溶性,影响传质过程。因此,选择10 min为最适超声时间。

图1 超声时间对BPA萃取效率的影响Fig.1 Effect of ultrasound time on extraction efficiency of BPA

2.1.4 有机溶剂的选择 图2实验结果表明,正辛醇的萃取效果最佳,其次是甲苯和氯苯,三氯甲烷和正己烷的萃取效率较低。原因是三氯甲烷与BPA的分子间作用力较弱,导致萃取效率较低,而正己烷具有挥发性,与BPA的分子间作用力较弱,萃取效率也不佳。甲苯与BPA间存在π-π相互作用力,增加了BPA的溶解度,但是π-π作用力没有氢键作用力强。正辛醇极性较高,与BPA之间除了分子间作用力之外,-OH还能与BPA苯环上的-OH形成氢键,从而增加了BPA的溶解度,提高萃取效率。另外,正辛醇粘稠度高、挥发性低、水中溶解度低,因此能有效固定在HFM孔隙中,保持萃取的稳定性。选择正辛醇为萃取溶剂。

图2 有机溶剂种类对BPA萃取效率的影响Fig.2 Effect of types of organic solvents on extraction efficiency of BPA

2.1.5 给体相和受体相的组成 由于BPA呈弱酸性,给体相溶液应该调节成酸性让BPA呈分子态,减少其在样品溶液中的溶解度。同时,为了保证BPA顺利穿透有机相传递到受体相中,受体相溶液应该调节成碱性让BPA呈离子态,以免被反萃取到有机相中。

如图3所示,BPA在pH=6时有最大峰面积值。因为BPA的pKa值为9.6,当pH=6时大部分以分子态存在,降低其在样品溶液中的溶解度,提高了BPA的萃取效率。另外,样品溶液酸度过高会使BPA质子化,影响其传质到有机相。因此选择pH=6的HCl溶液为给体相。

图3 给体相pH对BPA萃取效率的影响Fig.3 Effect of pH of the donor phase on extraction efficiency of BPA

结果表明(图4),随着NaOH浓度的升高,萃取效率逐渐增大,当NaOH浓度为0.12 mol/L时,BPA的萃取效率最高,然后萃取效率随之下降。在萃取过程中,BPA在HFM表面聚集,然后在氢键的作用下被萃取到有机相,随后在HFM内腔遇到碱溶液被离子化,又被萃取到受体相中,随着受体相NaOH浓度的增大,离子态的BPA不断增多,但如果NaOH浓度太高则会损坏色谱柱的填料,减少色谱柱的寿命。因此选择0.12 mol/L的NaOH溶液作受体相溶液。

图4 受体相浓度对BPA萃取效率的影响Fig.4 Effect of concentration of NaOH on extraction efficiency of BPA

2.1.6 盐效应 图5结果表明,BPA的萃取效率随着NaCl浓度的增大而增大,在60 g/L达到最大值。根据盐析效应,NaCl在水溶液中产生强烈的水合作用,降低了自由水分子的浓度,从而减少了BPA在给体相中的溶解度,有利于传质。然而,盐浓度过大后,导致样品溶液粘度过大,静电作用占主导地位,导致传质效率降低,萃取效率下降。因此确定NaCl的加入浓度为60 g/L。

图5 盐效应对BPA萃取效率的影响Fig.5 Effect of concentration of NaCl on extraction efficiency of BPA

表1 婴儿配方奶粉中BPA的超声辅助溶剂棒微萃取方法评价Table 1 Evaluation of ultrasound-assisted solvent bar microextraction method of BPA in infant formula milk powder

注：加标浓度分别为5、20、50 μg/L(n=6)。

2.1.7 搅拌速度 搅拌能加快液相微萃取的传质速度和提高萃取效率。图6表明,随着搅拌速度从300～600 r/min增大,峰面积随之增大,当超过700 r/min以后,搅拌过于剧烈导致部分溶剂棒受损,同时HFM表面附着很多气泡,影响传质和精密度。综合考虑,确定600 r/min为最佳搅拌速度。

图6 搅拌速度对BPA萃取效率的影响Fig.6 Effect of stirring rate on extraction efficiency of BPA

2.1.8 萃取时间 液相微萃取的萃取过程是动态平衡,不是完全萃取。结果表明(图7),BPA的萃取效率随着时间的延长而增大,15 min后萃取基本达到平衡。随着时间的延长,在萃取过程中会在HFM产生大量气泡,同时会造成溶剂棒的损坏,导致萃取失败。因此,在后续实验中选择萃取时间为15 min。

图7 萃取时间对BPA萃取效率的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction efficiency of BPA

2.2 方法性能评价

在最佳的超声辅助溶剂棒微萃取条件下,研究该技术应用于婴儿配方奶粉中BPA快速测定的线性范围、富集倍数和检出限等,具体数据见表1,萃取后的液相色谱图见图8。在最佳萃取条件下该方法对BPA的平均富集倍数为102倍。方法的线性范围为0.1～100 μg/L(r=0.9989),检出限为0.35 μg/L(S/N=3),加标回收率为89.7%～102.8%,测定的相对标准偏差小于4.32%。

图8 加标婴儿配方奶粉样品超声辅助溶剂棒微萃取后色谱图Fig.8 Chromatograms of infant formula milk powder sample spiked with standards

2.3 方法比较

将本方法与GB 31604.10-2016(食品接触材料及制品2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)迁移量的测定)相比较,本方法大大减少了有机溶剂的用量,降低了奶粉中复杂基质对于BPA的影响,操作简单,并大大简化了前处理的步骤。具有萃取时间短(30 min),检测限低(0.35 μg/L)、回收率高(89.7%～102.8%)、重现性好(RSD<4.32%)、溶剂用量少(8 μL)、净化能力突出和环境友好等显著优势。

2.4 实际样品的测定

为了进一步验证本方法的实用性,在当地超市购买两种不同品牌的婴儿配方奶粉,对奶粉样品进行超声辅助溶剂棒微萃取(具体步骤见实验部分1.2.2),测定结果见表2,并对实际样品进行加标回收实验,加标回收率为89.2%～103.5%,RSD低于4.48%。

表2 实际样品测定结果(n=6)Table 2 Results of real samples of BPA in infant formula milk powder(n=6)

注：ND表示未检出。

3 结论

建立了超声辅助溶剂棒微萃取-高效液相色谱联用快速测定婴儿配方奶粉中的BPA的新技术,最佳萃取条件:溶剂棒的有效长度为30 mm,超声处理10 min,以正辛醇作为萃取溶剂,pH=6的HCl溶液为给体相,0.12 mol/L NaOH溶液为受体相,NaCl的加入浓度为60 g/L,搅拌速度为600 r/min,萃取时间为15 min。在最佳操作条件下,对BPA的平均富集倍数为102倍。方法的线性范围为0.1～100 μg/L(r=0.9989),检出限为0.35 μg/L(S/N=3),加标回收率为89.7%～102.8%,测定的相对标准偏差小于4.32%(n=6)。本方法具有操作简单,萃取时间短,检测限低、回收率高、重现性好、溶剂用量少、净化能力突出和环境友好等显著优势,成功应用于实际婴儿配方奶粉样品的快速分析中,加标回收率为89.2%～103.5%,RSD低于4.48%。本方法在奶制品和其他食品分析中有广阔的应用前景。

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