两步酶法提取裂壶藻油的工艺优化

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(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心, 农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306; 3.广东省渔业生态环境重点实验室,广东广州 510300)

微藻是一类在陆地、海洋分布广泛、营养丰富、种类繁多的单细胞真核生物。微藻富含蛋白质、脂肪、糖以及氨基酸和多不饱和脂肪酸等多种营养物质,是生产食品、药品、高价值生物活性物质和生物柴油的重要原料[1-3]。大多微藻油脂的基本成分与植物油成分相似,但多富含多不饱和脂肪酸[4-5],而多不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质,具有十分重要的作用。部分微藻因可进行高密度异养发酵培养,是工业化生产富含多不饱和脂肪酸的微藻油的优质来源[6]。裂壶藻(Schizochytrium),是一类生活在海洋中的微藻,生长速度快,易于培养,油脂含量可以达到藻干重的40%以上[7-8]。裂壶藻油脂成分简单,二十二碳六烯酸(DHA)含量较高。DHA是ω-3系长链不饱和脂肪酸,是人体大脑的重要组成部分,俗称脑黄金,能促进婴幼儿的脑部和视力的机能发育,有利于智力、学习和记忆能力的提高[9-10],同时DHA还可以预防代谢紊乱,提高免疫功能和生殖健康,有效抑制血栓的形成,预防心血管疾病的发生等[11-12]。

水酶法是一种新兴的油脂提取方法,主要利用机械破碎油料,以水作为分解相,采用相关的酶(如蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、维生素酶等)在水相中水解油料细胞壁从而使油脂从油料中释放出来。利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同将非油成分和油分离[13-14]。水酶法提油作用条件较温和,且相关酶解产物不与提取的油脂发生反应,所得的油纯度高,品质好;操作的温度比较低,能耗小,可以有效保护环境[15-16]。目前人们有关于水酶法提取裂壶藻油的研究,大多是利用酶法提取油脂,然后用有机溶剂对酶解液进行萃取,裂壶藻的油脂提取率在60%左右[17],但这样会使用存在安全隐患的有机溶剂,同时油脂的提取率并未显著提高。本文采用组织研磨仪来破碎裂壶藻细胞,经碱提后,用中性蛋白酶来进行酶解,随后调整pH,添加碱性蛋白酶来继续酶解,在单因素实验的基础上,对清油得率影响较大的作用条件采用正交实验的方法进行优化,得到提取裂壶藻油的最佳工艺。并对所得的裂壶藻油利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行了分析,为进一步分离纯化裂壶藻油中的DHA提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

裂壶藻 由本实验室利用松花粉垂钓法对采自广州南沙红树林腐烂树叶进行分离纯化获得,经鉴定确定为裂壶藻,保存于本实验室藻种库中;细菌碱性蛋白酶(580000 U/g)Protex 6L、细菌中性蛋白酶(1600 U/g)Protex 7L 杰能科(中国)生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、Alcalase 2.4L(2000 IU)、胰蛋白酶(250 U/mg) 广州市齐云生物技术有限公司;柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、氯仿、正己烷、甲醇、石油醚 均为分析纯,广州华屿欣实验器材有限公司。

BS224S分析天平 美国Sartorius公司;HH-4快速恒温数显水浴箱 常州澳华仪器有限公司;Wonbio-48R高通量组织研磨仪 上海万柏生物科技有限公司;GCMS-QP2010 Plus气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪 日本岛津公司;IS126 pH计 上海仪迈仪器科技有限公司;IKA T25数显匀浆机 德国艾卡仪器设备有限公司;TDZ5-WS台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;SQ510C立式压力蒸汽灭菌器 日本YAMATO公司;ZQTY-70F台式全温振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;Avanti J-26XP高效离心机 贝克曼库尔特有限公司;DZF6050真空干燥箱 上海精宏仪器有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;Alpha1-4冷冻干燥机 德国Christ有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 裂壶藻的培养及收集 将分离纯化后的裂壶藻藻种以1%的接种量接入培养液中,培养液成分为:葡萄糖25 g/L,酵母提取物5 g/L,细菌学蛋白胨10 g/L,海水晶30 g/L,pH6.8。将接种后培养液放入全温振荡培养箱中进行摇瓶培养,摇瓶培养条件为:温度28 ℃、转速180 r/min,培养时间为96 h。摇瓶培养结束后收集培养液,在8000 r/min、温度4 ℃的条件下离心10 min,收集底部藻泥,在-20 ℃条件下预冻12 h,然后利用冷冻干燥机在-45 ℃条件下处理24 h得到裂壶藻藻粉。

1.2.2 油脂提取工艺 称取20 g裂壶藻粉,按一定的比例加入pH为4.8、浓度为0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,利用匀浆机处理5次;将均质后的藻液利用高通量组织研磨仪在55 Hz的条件下研磨150 s;调pH至9.5,温度60 ℃,匀速搅拌下碱提2 h;利用柠檬酸钠来调节体系的pH为6.5,加入一定量的中性蛋白酶,在一定温度条件下酶解一段时间,再利用NaOH调节pH为9.5,加入一定量的碱性蛋白酶,于恒温水浴箱中在一定温度条件下继续酶解一段时间;酶解完成后将酶解液于4800 r/min离心10 min后分层,取出上层游离油。将取出的游离油放入真空干燥箱中(103±2) ℃条件下处理0.5 h,冷却后称量,所得结果即为清油质量(g)。

1.2.3 清油得率测定

裂壶藻样品含油量的测定:称量20 g裂壶藻粉,采用氯仿-甲醇法[18]测量样品的总油脂量(g)。

1.2.4 酶种类的筛选 对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4 L、胰蛋白酶提取裂壶藻油进行实验,参照1.2.2进行前处理和碱提,然后分别加入5%的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase 2.4 L,中性蛋白酶在pH6.5、温度45 ℃,碱性蛋白酶在pH9.5、温度60 ℃,木瓜蛋白酶在pH7、温度50 ℃,Alcalase 2.4 L在pH8.0、温度55 ℃,胰蛋白酶在pH8.0、温度37 ℃的条件下酶解4 h,酶解完成后将酶解液在4800 r/min下离心10 min,收集上层清油,计算清油得率。

1.2.5 单因素实验 考察各因素(固定水平:料液比1∶6;中性蛋白酶添加量5%、温度45 ℃、酶解时间2 h、酶解pH6.5;碱性蛋白酶添加量10%、温度60 ℃、酶解时间5 h、酶解pH9.5)对裂壶藻清油得率的影响,考察的因素为:料液比1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9;中性蛋白酶添加量5%、7%、9%、11%、13%;中性蛋白酶温度40、45、50、55、60 ℃;中性蛋白酶酶解时间1、2、3、4、5 h;碱性蛋白酶添加量8%、10%、12%、14%、16%;碱性蛋白酶酶解温度55、60、65、70、75 ℃;碱性蛋白酶酶解时间3、4、5、6、7 h。以裂壶藻清油得率作为实验指标。

1.2.6 正交实验 在单因素实验的基础上采用正交实验对水酶法提取裂壶藻油的工艺进一步优化。选取对裂壶藻清油得率影响较大的4个因素(料液比、中性蛋白酶添加量、碱性蛋白酶添加量、碱性蛋白酶酶解温度)进行L9(34)正交实验。正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.7 裂壶藻油脂肪酸组成的分析

1.2.7.1 脂肪酸的甲酯化 取裂壶藻油500 mg,加入体积分数为14%三氟化硼-甲醇溶液2 mL,在60 ℃水浴的条件下进行甲酯化反应30 min,冷却至室温,分别加入1 mL正己烷和蒸馏水,振荡1 min,静置分层后,吸取上层有机层,挥干溶剂,用正己烷定容,过0.22 μm有机滤膜后,用GC-MS进行分析测定[19]。

1.2.7.2 脂肪酸的GC-MS分析 GC条件:DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度230 ℃;升温程序:110 ℃保持4 min,以10 ℃/min升温到160 ℃,保持1 min,最后以5 ℃/min升到240 ℃,保持15 min;载气为氦气,流量为1.52 mL/min;采用恒线速度,分流比为1∶30;进样量1 μL。

MS条件:离子源温度200 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 40～550;溶剂切除时间3 min[20]。

1.3 数据处理

每组实验做平行实验共三次,数值取平均值±标准差表示。表格以及单因素结果图都用Excel 2010软件绘制。

2 结果与分析

2.1 酶种类筛选的结果和分析

不同种类酶的清油得率结果如图1所示。由图1可知,碱性蛋白酶的清油得率最高,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的清油得率差距不大,胰蛋白酶的清油得率最低。因木瓜蛋白酶价格较高,所以综合酶的价格和清油得率等因素选择中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

图1 不同种类酶对清油得率的影响Fig.1 Effect of different enzyme on clear oil extraction ratio

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对清油得率的影响 料液比对清油得率的影响,如图2所示。当料液比小于1∶7 (g/mL)时,清油得率随着料液比的增大而增加,当料液比大于1∶7 (g/mL)时,清油得率开始降低。这是因为适当的料液比可以提高油料的出油率。料液比过低时,体系的粘度大,流动性差,酶与底物不能够充分接触反应;料液比过高时,酶和底物都被稀释,相互之间碰撞的几率降低,影响清油得率[21]。因此选择合适的料液比为1∶7 (g/mL)。

图2 料液比对清油得率的影响Fig.2 Effect of liquid/solid ratio on clear oil extraction ratio

2.2.2 中性蛋白酶作用条件对清油得率的影响

2.2.2.1 中性蛋白酶添加量对清油得率的影响 中性蛋白酶添加量对清油得率的影响,如图3所示。由图3可知,当中性蛋白酶添加量小于7%时,随着中性蛋白酶添加量的增加,清油得率不断升高;当超过7%后,清油得率的变化很小,因此选择合适的中性蛋白酶的添加量为7%。

图3 中性蛋白酶添加量对清油得率的影响Fig.3 Effect of neutral protease addition on clear oil extraction ratio

2.2.2.2 中性蛋白酶酶解温度对清油得率的影响 中性蛋白酶酶解温度对清油得率的影响,如图4所示。当温度在40～45 ℃范围内逐渐升高时,清油得率不断增高;当温度超过45 ℃后,随着温度的升高,清油得率逐渐降低,这是因为酶都有最适温度,温度偏高或者偏低都会抑制酶的活性,进而影响清油得率。因此选择合适的中性蛋白酶酶解温度为45 ℃。

图4 中性蛋白酶酶解温度对清油得率的影响Fig.4 Effect of neutral protease enzymatic hydrolysis temperature on clear oil extraction ratio

2.2.2.3 中性蛋白酶酶解时间对清油得率的影响 中性蛋白酶酶解时间对清油得率的影响,如图5所示。当时间小于3 h时,随着时间的延长清油得率不断增高,超过3 h后,清油得率变化很小,这是因为初期随着时间的延长,酶解反应逐渐完全,随后继续延长酶解时间对清油得率影响较小,且随着时间的延长,成本不断上升,因此中性蛋白酶的最适作用时间为3 h。

图5 中性蛋白酶酶解时间对清油得率的影响Fig.5 Effect of neutral protease enzymatic hydrolysis time on clear oil extraction ratio

2.2.3 碱性蛋白酶作用条件对清油得率的影响

2.2.3.1 碱性蛋白酶添加量对清油得率的影响 从图6中可知,随着碱性蛋白酶添加量的增加,清油得率不断升高,这说明酶用量越高,底物反应越完全,当碱性蛋白酶添加量超过10%时,由于底物浓度不变,增大碱性蛋白酶的添加量对清油得率的影响不大,因此从成本等因素考虑,碱性蛋白酶的添加量为10%。

图6 碱性蛋白酶添加量对清油得率的影响Fig.6 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis addition on clear oil extraction ratio

2.2.3.2 碱性蛋白酶酶解温度对清油得率的影响 由图7可知,当温度在55～65 ℃范围内不断升高时,清油得率不断增高;超过65 ℃后,清油得率有所降低。这是因为酶都有最适温度,当低于该温度时,酶活性被抑制,清油得率会较低,当高于该温度时,也会抑制酶的活性,温度过高时,蛋白质变性使酶部分或全部失去活性[22]。因此选择合适的温度为65 ℃。

图7 碱性蛋白酶酶解温度对清油得率的影响Fig.7 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis temperature on clear oil extraction ratio

2.2.3.3 碱性蛋白酶酶解时间对清油得率的影响 由图8可知,当碱性蛋白酶酶解时间在3～6 h范围内不断增加时,清油得率不断增高,当碱性蛋白酶酶解时间超过6 h后清油得率没有增高甚至还有少许的降低,这是因为随着时间的延长,酶解反应不断完全,已提取出来的游离态的油在搅拌以及温度的作用下发生部分乳化现象[23],使清油得率略有减小。所以碱性蛋白酶的最适作用时间为6 h。

图8 碱性蛋白酶酶解时间对清油得率的影响Fig.8 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis time on clear oil extraction ratio

2.3 正交实验结果与分析

在单因素的基础上,选取对裂壶藻清油得率影响较大的4个因素(料液比、中性蛋白酶添加量、碱性蛋白酶添加量、碱性蛋白酶酶解温度)进行L9(34)正交实验,正交实验结果如表2所示,并对表2中数据进行分析统计[24]。由分析结果可知,4个因素对裂壶藻清油得率的显著影响顺序为料液比(A)>碱性蛋白酶添加量(C)>中性蛋白酶添加量(B)>碱性蛋白酶酶解温度(D)。通过k值可以得出水酶法提取裂壶藻油的最优工艺条件组合为A2B3C3D3,即料液比1∶7,中性蛋白酶添加量9%,碱性蛋白酶添加量12%,碱性蛋白酶酶解温度70 ℃。在此条件下进行验证实验,得到的裂壶藻清油得率的平均值为90.22%,比正交实验所得的最高值还高0.41%,说明所选条件可行。

表2 正交实验设计与结果Table 2 Resign and results of orthogonal experiments

2.4 裂壶藻油脂肪酸组成分析

对最优条件下提取所得的裂壶藻油脂肪酸甲酯进行了GC-MS分析,最终所得的GC-MS图谱如图5所示。根据GC-MS联用仪获得质谱信息经数据库检索与标准谱图对照,分别为对色谱图进行面积归一化定量了各种脂肪酸的质量分数,结果表明裂壶藻油的DHA的质量分数为 32.06%,不饱和脂肪酸质量分数为44.13%。两步酶法提取的裂壶藻油与氯仿-甲醇法提取的裂壶藻油的脂肪酸组成进行对比分析,发现两步酶法提取的裂壶藻油脂肪酸组成和含量几乎没有变化,不饱和脂肪酸含量高,油的营养价值高。

表3 样品脂肪酸成分Table 3 Fatty acid composition of oil

图9 裂壶藻油的GC-MS图谱Fig.9 GC-MS map of oil from Schizochytrium sp.

3 结论

以裂壶藻藻粉作为原料,从几种商品酶中筛选出中性蛋白酶和碱性蛋白酶作为水酶法提取裂壶藻油的适宜酶制剂。

采用正交实验和单因素相结合的方法对裂壶藻油的提取条件进行优化,得到两步酶法提取裂壶藻油的最佳工艺条件为:料液比1∶7,中性蛋白酶添加量9%,酶解温度45 ℃,酶解pH6.5,酶解时间3 h;碱性蛋白酶添加量12%,酶解温度70 ℃,酶解pH9.5,酶解时间6 h。在该条件下裂壶藻的清油得率为90.22%。裂壶藻清油得率高,乳化程度低,乳油产量低,这是因为碱处理和酶处理均可以破乳,其中酶法破乳可以极大的提高破乳率,且油的品质好[25-26]。

通过GC-MS分析,裂壶藻油不饱和脂肪酸含量高达44.13%,其中DHA含量为32.06%。油脂中DHA含量较高,油的营养价值较高。

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