黄原胶/溶菌酶体系相转变及其DSC分析

, ,, ,, ,,宇凡

(1.信阳师范学院生命科学院,河南信阳 464000; 2.大别山农业生物资源保护与利用研究院,河南信阳 464000)

多糖和蛋白质是食品体系中主要的两类大分子,两者复合体系相行为在很大程度上决定了食品的微观和宏观结构[1-3],同时也影响着食品分子加工的功能特性、质构、稳定性等众多食品特性[4-6],因此多糖/蛋白质复合体系相行为的调节和控制一直被认为是食品领域的重要课题。然而大多数蛋白质和多糖对于外界环境的改变均很敏感,相转变较易发生,且很难控制,主要是因为多糖和蛋白质高分子易受电荷效应、离子强度、pH等因素的影响,并在很大程度上决定了多糖/蛋白质相转变的发生[7-9]。

黄原胶(XG)和溶菌酶(Ly)是食品体系中两种常见的配料分子,在以前的研究中利用葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)自动酸化降低黄原胶/溶菌酶体系的pH,原位改变分子所带电荷,从流变学及微观角度建立了XG/Ly共溶体系、可溶性复合物、三维网络结构连续相转变的发生参数[10];基于此环境诱导XG/Ly共溶体系条件下制备响应性XG/Ly纳米凝胶体系及其自聚集超结构体系[11]。本文基于前期研究基础,通过透光率变化建立XG/Ly复合体系相转变参数,同时通过热力学分析纳米凝胶进程中XG和Ly两种大分子热力学变化,探索两种大分子在XG/Ly纳米凝胶制备过程中的分子变化,分析其形成机理,为环境诱导条件下改善食品结构以及新食品的设计提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄原胶(XG) 上海源叶生物有限公司;溶菌酶(Ly,Mw 14.3 kDa) 从鸡蛋蛋清中提取,并二次结晶,购于国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖酸-δ-内酯(GDL) 国药集团化学试剂有限公司；实验中所用试剂 均为分析级；实验用水 均经过Milli-Q(MA USA)纯水净化系统处理。

UV-1700型紫外分光光度仪 日本岛津公司;204-F1型差示扫描量热仪 德国Netzsch公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液制备 准确称取XG和Ly样品,分别缓慢加入一定量超纯水中,配制浓度均为1 mg/mL的溶液。XG溶液在室温下搅拌6 h,Ly溶液搅拌2 h。XG和Ly溶液分别加入0.03%(w/w)叠氮化钠后放入4 ℃冰箱贮藏备用。分别用1 mol/L盐酸和氢氧化钠将XG和Ly溶液pH调至pH12.5,按照不同质量比(XG/Ly 3∶1、1∶1和1∶3)混合均匀，该体系分别标记为XL31、XL11和XL13。

1.2.2 动态pH和透光率测定 将上述不同XG/Ly质量(3∶1、1∶1和1∶3)体系,在室温条件下分别加入0.008%(w/v)葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)后利用数显pH计监测pH的变化,获得pH随时间变化曲线;重复上述操作,利用紫外可见分光光度计于600 nm测定不同XG/Ly体系在不同时间节点处的透光率,每组样品测定3次[12-13]。

综合同一时间点的pH和透光率,获得不同XG/Ly复合体系自动酸化过程中,透光率随pH的连续动态变化。相互作用点(Interconnection point,pHφ)以透光率曲线两端分别作切线,两切线交点对应的横坐标pH即为该条件下XG/Ly相互作用的pH点[14-15]。

1.2.3 XG、Ly在其纳米凝胶制备过程中DSC分析 利用差示扫描量热仪分析XG/Ly共溶状态两种高分子的变化。分别模拟XG及Ly在不同pH(12.5、12.2、12、11.8)及热处理(80 ℃,15 min)条件下,样品进行冷冻干燥处理。不同条件处理的XG样品分别标记为XG0、XG12.5、XG12.2、XG12、XG11.8及HXG12.5、HXG12.2、HXG12、HXG11.8,未处理、未加热处理、加热处理Ly样品将分别标记为Ly0、Ly12.5、Ly12.2、Ly12、Ly11.8及HLy12.5、HLy12.2、HLy12、HLy11.8。XG(3 mg)粉末样品放入铝坩埚中,以空坩埚作参比,扫描速率5 ℃/min,温度范围为0～350 ℃;Ly(5 mg)粉末样品放入铝坩埚中,加入10 μL超纯水,并加盖密封,于室温下平衡24 h[16],以空坩埚作参比,具体参数:扫描速率5 ℃/min,温度范围为30～90 ℃,整个测试过程是在N2保护下进行,吹扫气20 mL/min,保护气60 mL/min。

2 结果与分析

2.1 连续pH下XG/Ly透光率变化

为研究XG/Ly体系在连续pH条件下的相转变,采用在碱性环境下(pH12.5)加入GDL,使得XL31复合体系由于GDL缓慢酸化过程可连续降低体系的pH,图1所示当GDL开始酸化时,XG/Ly体系相转变也缓慢进行,XG/Ly体系的透光率随着时间的延长以不同速率下降。当pH较高时,XG与Ly均带负电荷,分子间强烈的静电相斥作用使得XG与Ly分子在高pH条件下以共溶的形式存在。但当pH下降时,Ly质子化后开始带正电荷,XG与Ly在静电驱动下形成复合物,使得复体体系的透光降低;当pH近一步下降时,逐步发生的聚集行为可导致XG/Ly体系形成微凝胶网络结构。这种相转变过程在乳清蛋白/果胶复合体系也被报道过,其相转变过程与XG/Ly体系相似[17]。

图1 XL31体系在酸化过程的透明度变化Fig.1 Transmittance of XL31 system during acidification process

图2 XL11(a)和XL13(b)体系在酸化过程的透明度变化Fig.2 Transmittance of XL11(a)and XL13(b) systems during acidification process

如图2所示,尽管XG和Ly的质量比有所不同,不同XG/Ly体系有着相似的规律,即透光率随着pH的下降而下降,均形成复合物。但这种相转变进程不但和XG/Ly体系自身组成有关,不同质量比的XG/Ly体系在pH下降的过程中有着不同的规律。最初相同pH条件下,不同XG/Ly体系的透光率不尽相同,这主要是由于XG和Ly本身就具有不同的透光率。在低Ly体系中(XL31),透光率随着pH的下降而下降,并在pH10.46左右处形成一个平台区,使得相转变有明显的阶段性。高Ly体系(XL11和XL13)的透光率在酸化过程中快速下降,其下降速率高于XL31体系,这说明Ly可加快XG/Ly体系相转变进程,这也与通过流变学分析XG/Ly体系相转变的结果相一致[10]。如图1和图2所示,XL31、XL11和XL13的相互作用点(Interconnection point,pHφ)分别为10.46、10.85和10.64,pHφ的数值也进一步反应XG/Ly体系中增加Ly含量有促进该体系发生相转变,而多糖起着相反的作用。这主要是因为更多的蛋白可以通过物理相互作用与多糖结合,体系电荷被中和,可以在更短的时间内达到能量较低的稳定状态[18]。Le等研究者也发现低密度的多糖可以使多糖/蛋白体系的粘度更低,这样可使得多糖蛋白分子链的运动扩散更为便捷,从而使相转变较易发生[19]。

2.2 Ly制备纳米凝胶过程中的DSC分析

图3 不同pH(a)及热偶联作用(b)条件下Ly的热力学图谱Fig.3 Thermogram of Ly disposed by different pH or coupled with heat treatment

通过差示扫描量热仪对Ly制备纳米凝胶进程进行热力学分析,如图3a显示了不同pH条件对Ly热稳定性的影响,结果表明在自然条件下Ly的热变性温度(Tm)为80 ℃,但当pH为12、12.2、12.5时,其热变性温度分别为99.4、98.7和109.7 ℃(图4)。Tm的提高说明增加pH会提高Ly的热稳定性,同时这种热力学稳定增强效应随着pH的升高而提高。XG/Ly共溶态制备纳米凝胶中,热处理是所采用的方法之一,碱热偶合处理Ly溶液的热力学分析如图3b所示。图3b显示在不同pH条件下,Ly的热变性温度变化规律同图3a一致,即使在热处理条件下,提高pH均可提高Ly的热变性温度,同图3a相比,其增强效应有近一步提高的趋势,当pH为12.5时,其热变性温度为113.5 ℃(图4)。同时在强碱性(pH12.5)热孵育条件下,在58 ℃处出现一个强烈的放热峰,这说明在该条件下,Ly的结构可能发生变化,如脱酰氨基作用的发生,这一点也与以前研究中红外光谱结果一致[20]。

图4 不同条件下Ly的热变性温度Fig.4 Thermal denaturation temperature of Ly disposed in different conditions

2.3 XG制备纳米凝胶过程中的DSC分析

图5 不同pH(a)及热偶联作用(b)条件下XG的热力学图谱Fig.5 Thermogram of XG disposed by different pH or coupled with heat treatment

如图5所示,同未处理的XG0比较,XG制备纳米凝胶过程中的热力学特性深受pH和偶合热处理的影响。虽然不同pH条件下的碱处理和偶合热处理XG热力学曲线均呈现一个强烈的吸热峰和放热峰,但与未处理的XG0比较均出现了较大的峰位移现象,说明在制备纳米凝胶过程中XG的分子构象出现了较大改变,导致其热力学特性随之改变。如图5,XG0在33 ℃及92.4 ℃显示出两个吸热峰,这与其它结果相一致[21-23],然而在碱处理XG体系中,XG11.8、XG12、XG12.2及XG12.5温度较低的吸附峰均未出现,只显示一个强的吸热峰,与XG0相比该峰均向高温方向出现了较大的移动;同时XG的吸热峰均向低温方向移动,说明碱热后的XG较天然XG热稳定性变差,而XG12.5未出明显的放热峰,此时XG可能已发生部分碱降解行为。碱处理后XG与XG0相较表现出较大差异,原因主要是其分子构象的变化,在碱处理下XG发生了脱乙酰行为,分子结构发生了改变,pH越高,脱乙酰行为发生的越快,使XG从柔性分子变为硬性分子,从而导致其热特性的较大改变[24-25]。

与碱处理XG相比,碱热偶合处理增加了XG热力学的变化。虽然碱处理是在强碱条件下进行的,XG胶乙酰行为已经完成,不需要加热进行辅助。但图5b与XG0相比较,碱热偶合处理仍对XG分子产生了一定影响,如HXG0放热峰明显比XG0宽,说明其热稳定性在一定程度上有所提高,与此同时HXG11.8、HXG12及HXG12.2均产生两个放热峰,说明体系中存在着两种构象的XG体系。这主要是因为碱热偶合处理一方面与单纯碱处相同,使XG发生了脱乙酰的化学变化,也使天然的五股螺旋结构发生了解旋行为,使原本稳定的结构发生破坏,形成单链的游离态,单链XG可在氢链作用形成有别于天然多股螺旋的不规则多股螺旋结构,从而导致热力学上的差异性。图5的结果也与以前的FTIR结果相一致,在碱热处理过程中,不仅XG结构中乙酰基的特征峰(1725 cm-1)消失,也表现出现出更强的疏水性[11]。

3 结论

XG/Ly复合体系在GDL连续酸化过程中,其相转变呈现pH阶段性,并受到XG和Ly比例的影响。XL31、XL11和XL13的pHφ分别为10.46、10.85和10.64,呈现出高Ly含量的XG/Ly体系相转变进程较快。XG/Ly共溶态制备纳米凝胶过程中XG及Ly原有结构均发生改变,碱或碱热偶合处理可提高Ly的热变稳定性,但在此过程中XG发生脱乙酰行为,并在加热处理过程中原有的多股螺旋结构解螺旋或发生重组行为。

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