气相色谱法测定食品中12种有机酸

王韦岗，唐双双，陆 源

（镇江市产品质量监督检验中心，镇江212132）

食品中的有机酸是一类重要的风味物质，是构成食品酸味的主要成分，其种类和含量对食品的风味和酸度都有重要影响［1－2］。食品中有机酸的种类很多，主要来源于原材料和生产发酵过程中，同时由于保存或者风味的需要，会添加丙酸、山梨酸、苯甲酸、柠檬酸等功能性添加剂，这些功能性添加剂也是食品中有机酸的重要来源之一［3］。因此，检测食品中有机酸的种类和含量，可以对食品的风味和品质进行监控，有利于提升产品的质量。

气相色谱法是测定有机酸的常用方法［4－6］，该方法在进样分析前需对有机酸进行硅烷化或者甲酯化衍生处理［7－8］，其中衍生条件直接影响有机酸测定结果的准确性。目前采用气相色谱法测定食品中有机酸的报道很多［9－12］，但是测定的有机酸种类较少，而且测定时未考虑衍生条件对测定结果的影响［13－15］。本工作采用硫酸－甲醇法对12种有机酸进行甲酯化衍生，衍生产物经三氯甲烷萃取后进行气相色谱分析。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 7890A型气相色谱仪，配7683B型自动进样器，氢火焰离子化检测器；WH－2微型涡旋混合仪；SB－800DT 型超声波清洗机；Sartorius 3－30K型离心机；DHG－9246A型电热恒温干燥箱；Millpore超纯水系统。

12种有机酸标准储备溶液：分别称取乙酸、乳酸、草酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸标准品各1．0g，丙酸、正丁酸、正戊酸、山梨酸、琥珀酸和苯甲酸标准品各0．10g，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，放置于4℃冰箱中避光保存。临用前，分别用水逐级稀释至所需质量浓度的混合标准溶液。

三氯甲烷、甲醇和乙酸为色谱纯，硫酸为优级纯，草酸、亚铁氰化钾和硫酸锌为分析纯，丙酸、正丁酸、乳酸、正戊酸、山梨酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、苹果酸和柠檬酸标准品的纯度均大于99．4%；试验用水为超纯水（电阻率为18MΩ·cm）。

1．2 仪器工作条件

Agilent HP－5毛细管色谱柱（30m×0．32mm，0．25μm）；载气为氮气（纯度不小于99．999%），流量为0．8mL·min－1；空气流量为400mL·min－1，氢气流量为30mL·min－1；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；分流进样，分流比为10∶1；进样量为1．0μL。程序升温：初始温度为30℃，保持2 min；以4 ℃·min－1速率升温到70 ℃；再以20℃·min－1速率升温到250℃。

1．3 试验方法

1．3．1 样品的提取

称取样品2．5g于25mL具塞刻度试管中，先加入水10．0mL超声提取10min，再分别加入106g·L－1亚铁氰化钾溶液2．0mL和300g·L－1硫酸锌溶液2．0mL，涡旋混匀后用水稀释至刻度。将稀释后的样品溶液转移至50mL具塞离心管中，于8 000r·min－1转速下离心5min。

1．3．2 样品的衍生

移取上清液2．0mL于10mL具塞刻度试管中，加入20%（体积分数，下同）硫酸－甲醇溶液4．0mL，涡旋混匀后放置在80℃电热恒温干燥箱中反应60min，冷却至室温。移取衍生反应后的溶液2．0mL于10mL具塞离心管中，加入水1．0mL和三氯甲烷2．0mL，混匀后以8 000r·min－1转速离心5min，移取下层三氯甲烷层，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

衍生后的12种有机酸混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 12种有机酸混合标准溶液的色谱图Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution of 12organic acids

2．2 衍生试剂的选择

取12种有机酸混合标准溶液5份，分别加入体积分数为0，5%，10%，15%，20%的硫酸－甲醇溶液，于80℃衍生反应60min，三氯甲烷萃取后进行测定，考察了硫酸－甲醇溶液的体积分数对测定结果的影响，结果见图2。

图2 硫酸－甲醇溶液的体积分数对测定结果的影响Fig．2 Effect of volume fraction of H2SO4－CH3OH solution on determination results

由图2可知：硫酸－甲醇溶液的体积分数对有机酸的甲酯化反应具有重要作用；反应体系中不含硫酸时，仅乙酸、丙酸、正丁酸、乳酸和正戊酸等低沸点易挥发的有机酸具有较好的信号响应；随着硫酸的加入，12种有机酸与甲醇的甲酯化反应得以顺利进行；在相同的时间内，随着反应体系中硫酸含量的增加，得到的12种有机酸衍生产物的峰面积也随着增加；当硫酸－甲醇溶液的体积分数为15%，20%时，12种有机酸衍生产物的峰面积相近。为保证样品中的有机酸能够完全甲酯化，试验选择衍生试剂为20%硫酸－甲醇溶液。

2．3 衍生试剂加入量的选择

取12种有机酸混合标准溶液5份，分别加入20%硫酸－甲醇溶液0，1．0，2．0，4．0，6．0mL，于80℃衍生反应60min，三氯甲烷萃取后进行测定，考察衍生试剂加入量对测定结果的影响，结果见图3。

图3 衍生试剂加入量对测定结果的影响Fig．3 Effect of amount of derivative reagent on determination results

由图3可知：衍生试剂的用量对低沸点易挥发有机酸的甲酯化反应影响较小，对高沸点有机酸的甲酯化反应影响很大；不加衍生试剂时，12种有机酸中乙酸、丙酸、正丁酸、乳酸和正戊酸等低沸点易挥发的有机酸出峰良好，高沸点有机酸没有或者仅有微弱的信号响应；随着衍生试剂的加入，高沸点有机酸在硫酸的催化作用下与甲醇发生甲酯化反应，沸点和极性均有所下降，从而提高了有机酸在气相色谱中的响应值；当衍生试剂加入量为4．0，6．0mL时，12种有机酸衍生产物的峰面积达到最大值，继续增加衍生试剂的加入量，12种有机酸衍生产物的峰面积无明显变化。试验选择衍生试剂的加入量为4．0mL。

2．4 衍生温度的选择

取12种有机酸混合标准溶液5份，加入20%硫酸－甲醇溶液 4．0mL，分别在 40，60，80，100，120℃衍生反应60min，三氯甲烷萃取后测定，考察了衍生温度对测定结果的影响，结果见图4。

图4 衍生温度对测定结果的影响Fig．4 Effect of derivative temperature on determination results

由图4可知：衍生温度太低不利于高沸点有机酸进行甲酯化反应；随着衍生温度的升高，高沸点有机酸衍生产物的峰面积逐渐增加；当衍生温度为60，80℃时，12种有机酸衍生产物的峰面积相近；随着衍生温度的进一步升高，低沸点有机酸的衍生产物发生分解，测定得到的峰面积逐渐减少；当衍生温度升高到120℃时，乙酸、丙酸、正丁酸和正戊酸等低沸点有机酸衍生产物的色谱峰消失。试验选择衍生温度为80℃。

2．5 衍生时间的选择

试验考察了衍生时间依次为0，10，20，40，60min时对测定结果的影响。结果表明：衍生时间对低沸点易挥发的有机酸影响较小，在很短时间内即可完成甲酯化反应，高沸点的有机酸甲酯化反应时间较长。通过对衍生产物峰面积的比较，试验选择衍生时间为60min。

2．6 萃取试剂的选择

分别采用2．0mL正己烷、二氯甲烷和三氯甲烷萃取12种有机酸混合标准溶液中12种有机酸的衍生产物，并按仪器工作条件进行测定，考察萃取试剂对测定结果的影响。结果表明：3种萃取试剂中正己烷的萃取效率较低，二氯甲烷和三氯甲烷萃取时具有较高的回收率，但是二氯甲烷与乙酸衍生产物的保留时间一致，并且无法将两者进行分离，采用二氯甲烷萃取衍生产物会干扰乙酸的测定。试验选用萃取试剂为三氯甲烷。

2．7 标准曲线及检出限

配制乙酸、乳酸、草酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸的质量浓度均依次为1．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10g·L－1，丙酸、正丁酸、正戊酸、山梨酸、琥珀酸和苯甲酸的质量浓度均依次为0．10，0．20，0．40，0．60，0．80，1．0g·L－1的混合标准溶液，分别移取上述不同质量浓度的12种有机酸混合标准溶液2．0mL，按试验方法进行测定。以12种有机酸的质量浓度为横坐标，其衍生产物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：12种有机酸的质量浓度均在一定范围内呈线性，线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N），结果见表1。

2．8 精密度和回收试验

称取2．5g样品4份，其中1份样品作为本底，另外3份样品中加入高、中、低不同浓度水平的12种有机酸混合标准溶液，按试验方法进行分析，精密度和回收试验结果见表2。表2中“－”表示未检出。

表1 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab．1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

表2 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：12种有机酸的加标回收率为76．0%～107%，相对标准偏差（RSD）为1．5%～6．9%。

空白样品和加标样品的色谱图见图5。

本工作建立了气相色谱法同时测定食品中12种有机酸的分析方法。本方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于食品中有机酸的测定。

图5 空白样品和加标样品的色谱图Fig．5 Chromatograms of blank sample and spiked sample

［1］ 丁明玉，陈培榕，罗国安．食品中有机酸的高效液相色谱分析法［J］．色谱，1997，15（3）：212－215．

［2］ 王韦岗，曹伟，朱新生．食醋中有机酸含量的测定及差异性分析［J］．食品发酵与科技，2013，49（2）：81－84．

［3］ 顾秀英，欧菊芳，王东铭，等．气相色谱内标法测定食品中多种常见防腐剂的含量［J］．食品科技，2012，37（12）：301－304．

［4］ 陈冰，肖珊美，温正如．气相色谱法测定环境空气中的微量乙酸［J］．光谱实验室，2012，29（2）：1279－1252．

［5］ 蒋次清，胡守毅，李忠，等．微波辅助衍生化－气相色谱法测定烟草中非挥发性有机酸［J］．理化检验－化学分册，2011，47（4）：392－394．

［6］ 张霞，刘志华，杨光宇．固相萃取富集／气相色谱法测定烟草中的9种有机酸［J］．分析测试学报，2014，33（5）：545－550．

［7］ 张迎春，蔡冰，郭国宇，等．烟草中非挥发性有机酸的甲酯化条件优化和定量分析［J］．华中农业大学学报，2010，29（6）：788－793．

［8］ 巩玉华，蒋挺大．有机酸的快速硅烷化气相色谱分析［J］．中国环境监测，1989，5（2）：18－20．

［9］ 杜曦，周锡兰，余录．衍生化气相色谱法测定葡萄酒中多元有机酸［J］．西南民族大学学报，2007，33（6）：1365－1368．

［10］ 高芸，朱晓兰，杨俊．毛细管气相色谱法分析猕猴桃中的有机酸［J］．食品科学，2007，28（1）：273－275．

［11］ 刘琼．浅析单柱离子色谱法与气相色谱法分析白酒中有机酸微量成分［J］．酿酒，2001，28（4）：56－58．

［12］ 张伟，李晓君，张静，等．柱前衍生－气相色谱法同时测定功能食品中8种有机酸［J］．分析试验室，2014，33（2）：175－179．

［13］ 王洪丽，李成云．气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸［J］．饲料工业，2008，29（16）：58－60．

［14］ 袁蕊，敖宗华，丁海龙．高粱中脂肪酸和低分子有机酸气相色谱测定［J］．酿酒，2011，38（4）：42－43．

［15］ 苗延林，邢朝云，刘艳．气相色谱分析啤酒中挥发性有机酸的简单方法初探［J］．中国酿造，2007，166（1）：61－63．