缺血性脑卒中在Wnt信号通路上与血管新生的研究概况

1.甘肃中医药大学， 甘肃 兰州 730030； 2.甘肃省中医院， 甘肃 兰州 730050

脑卒中俗称中风，是指由于急性脑血管血供障碍导致的局限或全面性脑功能缺损综合征或急性脑血管病事件[1]。目前，脑卒中己成为严重威胁人类健康的重大疾病，在中国脑卒中发病率排名世界第一，近几年流行病学统计，脑卒中年死亡人数达200万，年增长率为8.7%，并且随着人口老龄化的日益严重，这个数字还会随着时间增加而增加。其中缺血性脑卒中占卒中患者的87%，是备受关注的重大疾病[2]。现在，神经科学研究的重要课题已经着眼于如何有效减轻脑缺血再灌注损伤和促进脑缺血后的再生反应。其中，再生反应中的血管新生是一种动态复杂的过程，由多种细胞因子和多种细胞成分参与[3]。近年来，关于脑血管发育的研究表明，Wnt信号通路在调节脑血管新生过程中起着至关重要的作用[4]。

1 缺血性脑卒中的发病机制

由于各种原因导致的局部脑组织血流量减少，区域组织供血障碍，导致病灶部位的神经元坏死而引起脑功能障碍[5]。其中梗死灶的可逆程度取决于闭塞动脉的大小和侧支循环的有效建立，通过增加缺血半暗带的血流灌注而恢复神经功能[6]。缺血导致血管内氧和葡萄糖供应减少，能量生成不足，细胞膜上ATP依赖的Na、K-ATP泵活性受到抑制，膜电位消失，Na+的内流和K+的外流使神经细胞发生去极化，同时，细胞间隙谷氨酸累积，NMDA受体和谷氨酸受体激活，细胞外的大量Ca2+内流，细胞内的钙超载导致细胞结构发生破坏，大量自由基生成，该过程激活多条信号通路[7-8]。在缺血区域，虽然脑血流量只减少20 %，但是能量代谢和离子变化导致的缺血去极化发生的非常迅速，该过程使细胞快速死亡，其中致死区与正常区域的中间区域-缺血半暗带的血流恢复就是决定是否发展为梗死灶的关键部位[9]。

2 缺血性脑卒中与血管新生

缺血性脑卒中患者的大脑缺血损伤部位病理学上可分为两部分:一部分是不可逆的梗死脑组织区域，另一部分是处于缺血状态但未完全梗死的区域，称为缺血半暗带(ischemic penurnbra,IP)。多数学者认为缺血半暗带在缺血后1 h后出现，发展为最终梗死的时间窗为24 h,甚至可至48 h[10]。故在此动态发展过程中，在有效时间窗内恢复血流低灌注状态促进血路再通可恢复为正常组织。所有缺血脑卒中治疗的目的都是为了恢复缺血半暗带的血流量，减少最终核心梗死区域面积的大小。根据其发病的病理生理特点，目前缺血性脑卒中的临床治疗主要是超早期溶栓、急性期神经保护及恢复期神经血管结构与功能的修复。但由于溶栓药物的治疗狭窄的时间窗以及对病人标准的严格筛查，绝大多数患者得不到有效救治；此外，虽已证实部分神经保护药物在基础研究中有效，但临床应用中减少缺血性脑卒中患者大脑梗死面积和缓解由于卒中引起的致残方面并未显示出应有的疗效。因此，恢复期神经血管结构与功能的修复逐渐得到越来越多的关注，目前有研究[11]表明缺血性脑卒中后内源性血管新生在改善脑组织功能中有重要作用，其新生成的血管可以增加缺血区脑组织的氧供和营养物质，挽救濒危组织。故血管新生是治疗缺血性脑卒中的潜在靶点，刺激血管新生可以作为治疗缺血性脑卒中有效手段。

出生后的成体血管形成主要有两种方式，分别为血管生成和血管发生。血管生成是指已经存在的血管上的现有的内皮细胞通过激活，冲破管壁基层，迁移、增殖和重构，出芽而生成新的血管网，向这种组织和器官输送氧气。这是组织生长和发育的正常生理过程，也是机体应对缺血损伤的应激反应。而血管发生是一种完全的血管新生的方式，当机体发生组织损伤后，通过内源性和外源性性的作用一系列诱导因子在一定时间内通过直接或间接的方式释放到受损伤部位周围，使骨髓中的EPCs转移到外周血中，经过分化、迁移、增殖各步骤完成血管新生。EPCs是内皮祖细胞，既可以直接分化为内皮细胞参与血管生成的过程，同时也可以产生各种促进血管生成所需要的生长因子，而完成血管发生的过程[12]。有实验[13]表明，在大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型中，梗死区域周边的缺血半暗带的EPCs在缺血后12～24 h内就分泌增加，3 d后血管密度与正常大脑血管密度比较明显增加。Hayashi等[14]研究发现该过程持续时间甚至超过21 d。缺血性脑卒中的对中枢神经系统的损伤是源于损伤区局部脑血管血流的中断和减少，因此该区域的血流再生修复对中枢神经系统的恢复也有极为重要的影响，EPCs作为影响血管新生的重要因子，它的数量可以作为内皮细胞修复的重要标志。HECHT N等[15]研究表明，用SD大鼠制作成脑缺血模型后，将骨髓EPCs移植到该模型中，可以增加毛细血管密度，促进血管新生。近年来，在治疗血管新生的过程中，通过调节促血管生长因子，调控内皮细胞分化为血管已成为重点研究方向[16]。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是直接或者间接介导血管新生的主要因子，来源于骨髓干细胞，是成熟血管内皮细胞的前体细胞，能定向分化为成熟的内皮细胞，动员和归巢是EPCs参与缺血区域血管新生的关键部分[17]，在生理和病理的刺激下，骨髓中的EPCs应激性向外周血进行迁移，动员到外周血的EPCs分化为成熟EPCs并作用于损伤部位，而促进血管新生。影响EPCs动员的因素有内源性因素、外源性因素和某些药物。内源性因素其中最主要的信号就是缺血，通过上调体内HIF-1α的水平[18-19]，使血管中的内皮生长因子(VEGF)表达增加，从而诱导骨髓中EPCs向外周血动员。某些细胞因子和趋化因子可以刺激骨髓中的EPCs向外周血中移动，与内源性因素一同促进血管新生。

内皮祖细胞区别其他细胞主要靠其表面标志物，包括CD34、CD133、VEGER-2等。CD34是1997年ASAHARA等[20]首次从人外周血单核细胞中分离出来，是一个重要的造血干细胞表面标志物，也是早期胚胎血管的表面标记，是识别EPCs的重要标志之一。从骨髓和外周血中提取的细胞促进血管新生，并迅速分化为体内内皮细胞。CD133在1977年被作为一种表面抗原而发现，在线虫的干细胞中表达，而不是在成熟内皮细胞或单核细胞中。VEGER-2是成熟内皮细胞中最常表达的标记，也表达在循环的内皮细胞上。它来源于造血干细胞，具有繁殖和释放生长因子的能力[21]。这些联合表达干细胞的表面标志物被认为表达特有表面抗原CD34+、CD133+、VEGER-2+的细胞在体内外具有分化成为成熟内皮细胞的能力[22]。现通常采用CD34+作为鉴别EPCs的标志。研究报道，Kocher等[23]给无胸腺的大鼠造成心梗模型后注射在体外扩增后的CD34+细胞，结果证实模型缺血区毛细血管密度明显高于对照组，血管新生数量明显增加。

3 Wnt信号通路

Wnt通路是一条研究的较成熟的信号通路，Wnt通路上的蛋白与靶细胞表面特异性受体相互作用，导致细胞内的一系列反应，进而参与对胚胎干细胞的增殖、分化、凋亡等病理生理的调控，建立细胞的极性[24]。

Wnt信号通路分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，经典Wnt信号通路因其下游信号受β-catenin调控，故称为Wnt/β-catenin信号通路，β-catenin作为核心分子在该通路上起重要调节作用。非经典Wnt信号通路又称为β-catenin非依赖性通路，Wnt信号通路由配体蛋白、细胞膜表面相应受体及细胞质内信号物质构成。Wnt蛋白家族中包括19种蛋白亚型，是一种分泌型蛋白家族，由350～400个氨基酸对其编码，其中有24个保守的半胱氨酸。按照通路不同，Wnt蛋白分为两型，经典Wnt信号通路(β-catenin)蛋白为Wnt-1族，包括Wnt1、Wnt3a、Wnt8a等；非经典Wnt信号通路蛋白为Wnt-5a族，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7b等[25]。

3.1 经典Wnt信号通路 经典Wnt信号通路是血管生成的重点调节通道，主要是细胞外Wnt配体与细胞膜上的受体结合，提高细胞质内β-catenin蛋白的稳定性，促进其移位至细胞核，激活下游靶基因的表达。β-catenin在细胞核的累积受到其蛋白稳定性、入核、出核等多个层面的调控，是Wnt信号通路的关键因子。氯化锂(Licl)是一个典型的Wnt信号通路激活剂，通过抑制了糖原合成酶激酶-3β从磷酸化的β-catenin链中生成，从而导致了活性β-catenin链肽的积累，这些多肽链转移到细胞核中，从而激活信号因子，如Tcf/Lef，与该信号因子结合后，最终激活与细胞增殖、分化相关的下游靶基因的表达。然而，dickkopf-1(DKK-1)是一种典型的Wnt受体，它与Wnt受体的低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(Irp5/6)结合，从而抑制了一个模板受体复合物的产生，起到阻止β-catenin的信号传导。所以，在激活剂(Licl)的刺激下，在细胞质聚集的β-catenin促进其转位到细胞核，结合联合因子Tcf/Lef-1来刺激基因转录，而Wnt受体DKK1与Irp5/6结合，使β-catenin信号封锁，在核转位上的显示很少。实验[26]表明，在大鼠脑缺血发生时，Wnt信号通路中的抑制剂DKK-1在缺血区和缺血半暗带区被抑制生成，表达水平降低，从而增加Wnt/β-catenin信号通路的活性，内源性的促进血管新生，减轻因缺血对脑组织的损伤。故经典Wnt/β-catenin信号通路参与了缺血性脑卒中发生后血管新生和对神经功能保护的过程。

3.2 非经典Wnt信号通路 Wnt还可以通过刺激其他受体激活非经典Wnt信号通路。包括平面细胞极性通路和Wnt/Ca依赖通路等。Wnt/Ca通路目前普遍认为是通过Wnt5a和Wnt11激活G蛋白，进而刺激PLC和PKC分泌，从而引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca敏感信号激活，增加细胞运动和细胞粘着性[27]。并且，Wnt/Ca信号通路可以激活Ca MKII进而活化转录因子β活化激酶1(TAK-1)，使Wnt受体的低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(Irp5/6)磷酸化，阻止β-catenin的聚集。Wnt/JNK信号通路是Wnt配体激活JNK和ROK通过GTPase/Rho A中介，然后激活的JNK和ROK进入细胞核，与转录因子c-Jun和ATF2结合后进一步调节基因的表达。

4 血管新生与Wnt信号通路

有研究[28]表明，Wnt蛋白存在于血管中，是参与脑血管生成的重要调节介质，激活或抑制Wnt信号通路对胚胎或成体血管生成都可以起到一定控制和调节作用。故通过调节Wnt信号通路上的蛋白而增加血管新生已成为现在治疗缺血性脑卒中的研究热点。血管细胞通过该通路对Wnt信号作出反应，血管生成的过程遵循了Wnt/β-catenin信号通路的基本调控原则，该通路在血管生成、血管重塑和分化的许多方面都有涉及；还包括血管的出芽，血管网的成熟[29]。除了经典Wnt信号通路，非经典通路对血管新生的过程中也发挥着重要调控作用，对不同时期的形成既有正调控作用，也有负调控作用，经典Wnt通路主要通过刺激血管中存在的Wnt蛋白，与细胞上受体结合后，使细胞质内β-catenin转移到细胞核，激活下游靶基因，从而促进血管内皮细胞的表达，新生血管数量增加。非经典Wnt信号通路中Wnt/Ca通路主要通过钙依赖激酶、钙调节蛋白和转录因子N-F-AT起作用。激活Wnt/Ca通路可以导致细胞内Ca2+释放，从而激活Ca MKII，Ca MKII被认为是Wnt/Ca通路中的关键蛋白[30]。有实验[31]表明，Wnt配体(Wnt1 ，Wnt3a ，Wnt5 a 和Wnt7 b) 可以促进EPCs的增殖而促进血管新生，阻断Wnt/β-catenin信号通路将会影响血管新生[32]，表现在毛细血管数量减少，毛细血管床丧失等方面。研究表明[33]，促进血管新生的相关因子是Wnt/β-catenin信号通路上的靶基因，用氯化锂(Licl)激活Wnt信号通路后，生长因子的表达上调；而用抑制剂DKK-1后，血管新生的相关因子表达明显下调。故说明，经典Wnt信号通路与非经典Wnt信号通路起到协同调控作用，共同调节缺血性脑卒中发生后血管新生的调控。

5 展望

目前，缺血性脑卒中已成为最主要的致死因素和致残因素，并且随着中国老龄化的增加，其发病率、致残率、死亡率和复发率都持续升高，严重威胁着人类的生命，影响着生存质量。所以临床治疗缺血性脑梗死为重中之重，其主要治疗的超早期溶栓，因狭窄的时间窗以及对患者标准的严格筛查，并不能对患者进行有效治疗，因此神经血管结构与功能的修复已得到越来越多的关注。及时恢复缺血半暗带的血流，促进血管生成，提供给缺血区脑组织足够的氧供和营养物质，保护神经元细胞是治疗缺血性脑卒中的有效手段。研究Wnt信号通路与血管新生的作用可为治疗缺血性脑卒中提供新的治疗思路。