斑马鱼在药学领域的应用研究

祁美娟，石美智，韩永龙

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；2. 上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科，上海 201306)

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)是辐鳍亚纲鲤科短担尼属的热带观赏性淡水鱼。斑马鱼最早被用于水体污染，致畸和有毒物质的检测[1]。1981年，美国生物学家Streisinger等[2]首次在Nature上发表了关于斑马鱼的文章，介绍了斑马鱼是将遗传学、胚胎学和分子生物学有机结合的一种理想模式动物，此后斑马鱼被广泛用于科学研究中。

斑马鱼相比哺乳动物是体外受精，且胚胎透明，可观察到内部的组织器官。成年斑马鱼体长4～5 cm，胚胎可置96孔板中培养，培育成本较低。斑马鱼繁殖周期短、产卵数量多，可用于大规模药物筛选。斑马鱼给药方式简单，直接将药物溶于水中，鱼可通过皮肤、鳃、消化系统等来吸收，相比传统给药方式操作简单，节约试剂。科学家Howe等[3]研究了斑马鱼的基因组序列，发现斑马鱼与人的相似基因可达87%。当把引起人类疾病的基因注射到斑马鱼胚胎中时，斑马鱼最终获得了同样的疾病，所以斑马鱼被广泛用于遗传疾病(如抑郁症)、精神分裂症和帕金森病的研究。研究表明，斑马鱼与人类一样可表达多种药物代谢酶，如I相代谢酶细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)及II相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGT)和磺基转移酶 (Sulfotransferase,SULT)等[4]。随着科学实验的发展，斑马鱼在生物医学中的应用越来越多。由于斑马鱼自身的一些优点，使其在药学领域的作用越来越重要。本文查阅了近年来国内外斑马鱼在药学领域研究的文献，对其研究进行归纳、整理，为以后斑马鱼在药学领域的应用提供新思路。

1 药物代谢的研究

1.1斑马鱼的药物代谢酶CYP450是单加氧酶超家族，其中CYP1、2、3家族是异种生物转化和活化的关键酶。在人体中有5个CYP酶亚型，即CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5，占肝脏中CYP含量的65%，这些酶可负责大约70%的临床药物氧化[5]。研究表明，斑马鱼同人类一样可表达I相代谢酶(CYP450)和II相代谢酶(UGT、SULT)。Stegeman等[6]研究发现，斑马鱼有94个CYP基因，根据氨基酸序列的同一性可分为18个基因家族，这和人类及其他哺乳动物一样。CYP基因中5-51家族有32个基因，且和人类的CYP基因属直系同源，这些基因序列的高度相似提示人和斑马鱼酶活性的一致性。Huang等[7]通过识别和克隆完整的斑马鱼UGT基因库发现，斑马鱼基因组包含45个UGT基因，可分为3个家族：UGT1、UGT2、UGT5。UGT1 和 UGT2都被分成两个基因簇：a和b。UGT1a、UGT1b、UGT2a、UGT2b基因簇都包含了可变区域和不变区域。UGT5基因是一类新颖的UGT基因家族，只存在于硬骨鱼和两栖类中。

斑马鱼作为药物代谢的模型，主要是由于斑马鱼的基因与人类基因具有相似性。人和斑马鱼的CYP1和CYP3家族中有部分基因是直系同源，斑马鱼CYP1A和人CYP1A1、CYP1A2有相似的外显子结构，斑马鱼的CYP1B1和人的CYP1B1也非常相似。但是，异生代谢酶CYP 1-4家族中，斑马鱼有47个CYP2基因，而人类只有18个[8]。斑马鱼的CYP5A1与人的CYP5A1基因保持48%的序列同一性，这说明斑马鱼与人共享CYP5A的合成区域。斑马鱼CYP3A65基因是人CYP3A4同源物，在斑马鱼肝脏中表达量占54%，斑马鱼CYP3A65与人CYP3A4相似可被异种生物地塞米松和利福平诱导[9]。

1.2斑马鱼药物代谢的研究Alderton等[10]在常规的药理和毒理实验中，分析常用的人CYP酶探针底物在斑马鱼幼体中的代谢情况，发现他克林(CYP1A2)、双氯芬酸 (CYP2C9)、安非他酮(CYP2B6)、睾酮(CYP3A4)在受精7d后的斑马鱼幼体中发生羟化反应。对化合物西沙必利、氯丙嗪、维拉帕米、睾酮和右美沙芬代谢物的分析发现，在斑马鱼幼体中能催化发生Ⅰ相代谢反应(氧化、N-脱甲基、O-脱乙基和N-脱烷基)和Ⅱ相代谢反应(硫酸化和葡萄糖醛酸化)。非那西丁(CYP1A2)和右美沙芬(CYP2D6)分别能被代谢为扑热息痛和右啡烷，这与人体的代谢产物一致[11]。7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD)能将7-乙氧基香豆素代谢为7-羟基香豆素，表明斑马鱼有CYP2酶活性；斑马鱼辛基甲氧基试卤灵(OOMR)代谢为试卤灵，显示其有CYP3酶活性。斑马鱼原代肝细胞能将睾酮代谢为6β-羟基睾酮，说明斑马鱼能发生人CYP3A4的特征反应[12]。

2 中药的研究

斑马鱼在中药中的应用研究也比较普遍。陈侃等[13]利用斑马鱼研究7种中药单体的降脂作用。通过高脂饮食构建斑马鱼高脂血症模型，使用油红O染色，研究7种中药单体对斑马鱼血脂的影响，通过检测斑马鱼血清总胆固醇、甘油三酯验证药物的降脂作用，并初步探讨药物降脂的可能机制。结果显示，高脂饮食后斑马鱼幼鱼血脂升高，经7种中药单体处理后，油红O染色显示大黄酚能降低斑马鱼幼鱼血脂。高脂饮食的成年斑马鱼经大黄酚药浴8周后血清总胆固醇、甘油三酯水平均下降。大黄酚增加斑马鱼肠蠕动的频率，加速肠道排空。结果表明，大黄酚可降低高脂饮食后斑马鱼的血脂水平，其机制可能是大黄酚加快了高脂食物从肠道排出，减少了肠道对脂质的吸收。

当归是一种妇科疾病常见治疗药物，具有补血活血、调经止痛等功效。Zhong 等[14]利用斑马鱼模型研究当归提取物对血管新生的影响，发现当归提取物可以诱导斑马鱼胚胎肠下静脉的新生血管的变化。Zhao等[15]利用斑马鱼的血管损伤模型发现，当归提取物SBD-4能复原斑马鱼的血管，说明当归提取物可以作为一种治疗血管新生不足类疾病的潜在药物。

Liu等[16]采用转基因斑马鱼胚胎血管生成模型，通过对地黄水提取物的不同萃取部位进行了活性筛选，并对其活性部位主要化学成分进行了血管药效学研究。研究表明，地黄水粗提取物可增加斑马鱼肠下静脉毛细血管形成数量，且有促进血管生成的作用。

3 药物毒理学的研究与安全性评价

斑马鱼最早被用于水体污染、致畸和有毒物质的检测，现已成为一种有效评估药物毒性和安全性的动物模型。斑马鱼作为药物毒理学模型，具有实验用药量少、费用低、实验周期短、高通量等特点，又具有可观察的器官，可以进行药效学、药动学、评价代谢物活性等实验研究。目前，斑马鱼模型已被用于水体检测、心血管毒性、肝毒性、肾毒性、行为学毒性等应用研究。

李春杰等[17]建立细胞色素P450 CYP3A65荧光标记转基因斑马鱼模型，用于检测污水中常含有的重金属( 铜、镉、锌) 及类二噁英化合物五氯联苯( PCB126) 等环境污染物。结果显示，绿色荧光在此转基因斑马鱼模型的肝和消化道中表达；该转基因斑马鱼对3种重金属及PCB126产生响应，使此模型应用在环境污染物的检测上成为可能。

此外，斑马鱼也被用于评价农药的安全性，如用斑马鱼研究有机氯农药(艾氏剂、林丹、毒杀酚等)、有机磷农药(甲胺磷、毒死蜱、杀虫畏等)、杀菌剂(福美双、多菌灵、代森锌等)的毒性，评价这些农药的安全性及其对环境的影响[18]。

4 药物筛选与新药发现

斑马鱼为良好的脊椎动物模式生物，随着研究的深入，斑马鱼在疾病模型和药物筛选领域的应用越来越广泛。近年来，科学家利用斑马鱼探索出新的疾病模型和筛选技术，找到了一些活性化合物，并且这些化合物在哺乳动物中也有相似效果，如前列腺素E2和来氟米特已经进入临床试验，分别用来促进脐带血细胞移植后的增殖和治疗黑素瘤。这表明斑马鱼模型很适合用于药物筛选[19]。

张红翠等[20]采用MTT法检测顺铂、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶4种药物对HL-60和Hela细胞的增殖影响，并观察药物对斑马鱼胚胎发育的影响。结果显示，阿霉素、顺铂及紫杉醇作用于HL-60及Hela细胞的IC50均明显高于作用于斑马鱼胚胎的LD50，而5-氟尿嘧啶作用于肿瘤细胞和斑马鱼胚胎的结果与其它药物相反，4种抗肿瘤药物对斑马鱼胚胎的生长发育均有致畸作用。

帕金森病是老年人群中常见的神经退行性疾病之一，患者运动失调，身体僵硬震颤。帕金森病的病理特点是多巴胺能神经元减少和大脑出现路易氏小体。临床上常用左旋多巴和苄甲炔胺来治疗帕金森病，但不能根治。研究发现，斑马鱼的神经系统跟人相似，将胚胎用神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶 (MPTP)处理后，出现多巴胺能神经元数量减少和运动迟缓等症状，这种症状可被苄甲炔胺缓解，而且，MPTP和苄甲炔胺的作用机制在人和斑马鱼间是保守的，都要通过单胺氧化酶来起作用[21]。斑马鱼的胚胎没有血脑屏障，有利于药物进入脑。斑马鱼是很好的帕金森病模型。

5 再生药物的研究

现已有文献证明，斑马鱼的寿命在实验室培养可能会超过5年[22]。斑马鱼已迅速发展为细胞和生物发育的桥梁。斑马鱼受精10 h后原肠胚就发育完成，所以有学者推测斑马鱼可成为医学、生物学和再生医学关于研究细胞和亚细胞的模型。斑马鱼的鳍、心脏、视网膜、视神经、脊髓、肝脏及感觉毛细胞等都具有很强的再生能力，所以其在心脏、神经系统、肝脏、鳍再生医学中都有进一步的研究[23]。

6 结语

动物实验在科学研究中起着重要作用，虽然细胞培养实验被广泛应用，但实验结果与体内预测结果有一定差距。以哺乳动物为例，其饲养成本高、实验周期长，因此，寻求新的实验动物模型很有必要，其中包括无脊椎动物和鱼。生物医学的研究发现，斑马鱼基因和代谢酶接近人类，体外胚胎发育快速，生理复杂，器官容易观察，模型空间小，成本低，这些使得斑马鱼成为一个非常重要的动物模型。随着集约化水产养殖的发展，养殖密度过大、饲料设计欠合理、投喂频率过高等因素，广泛引起鱼类出现脂肪肝。脂肪肝致使鱼类游动缓慢、食欲降低，严重影响养殖鱼类生长及抗病能力，诱发养殖鱼类病害，对水产养殖造成巨大经济损失，制约着水产养殖业的发展，所以解决斑马鱼的饲养问题，可以预见斑马鱼将在药学领域乃至医学领域将发挥巨大作用。

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