锌指蛋白A20在动脉粥样硬化中的研究进展

卢 珊，罗 云，孙桂波，孙晓波

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

1 A20的结构与功能

锌指蛋白A20又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFα-induced protein 3,TNFAIP3),是1990年研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)对人内皮细胞作用时发现的。人体中编码A20的基因位于6号染色体，由790个氨基酸残基组成蛋白，分子量为90 ku[2]。A20由N末端区(1-385)和C末端区(386-775)2个功能结构域组成，前者含有半胱氨酸蛋白酶结构域OUT，靶向K63连接泛素化链作用受体蛋白1(receptor interacts with the protein kinase 1，RIP1)，从RIP1上去除K63连接泛素链，具有去泛素化酶活性；后者具有7个重复的Cys2/Cys2锌指结构，第4锌指有E3泛素连接酶功能，启动RIP1的K48连接泛素链的泛素化[3]。因此，A20具有去泛素化和泛素化双重功能。A20对NF-κB的抑制作用高度依赖于它的泛素化和去泛素化作用。

A20在全身各组织细胞均有表达，是一种诱导性蛋白质，基础A20水平在大多数细胞中很难检测到，当收到危险信号时，A20能以NF-κB依赖的方式快速产生。A20能有效抑制TNF-α和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)引起的凋亡，以及NF-κB和激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)转录因子的活化[4]。A20对NF-κB信号通路起负反馈调节作用，同时也对体内炎症反应起一定抑制作用。

2 A20的生物学特性

A20的生物学特性之一是具有细胞保护作用，能够保护一些细胞类型免受特殊的刺激物引起的细胞死亡。早先研究表明，A20通过抑制死亡结构域接头蛋白(tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein，TRADD)和RIP募集到肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR1)死亡结构域，阻止caspase-8酶原裂解，以及随后的瀑布式级联反应，进而抑制TNFR1介导的细胞凋亡。Onizawa等[5]近期发现，A20可以抑制细胞坏死，主要是通过抑制RIPK1-RIPK3复合物的形成，而不依赖于半胱天冬蛋白酶(caspase)级联反应。Won等[6]发现，A20通过抑制TNFR1下游凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号活化，抑制细胞凋亡。但A20的抗凋亡功能并不适用于所有的细胞系，如A20可以保护内皮细胞免受TNF和Fas引起的凋亡，但不能保护A549、HepG2、HeLa细胞[2]。值得注意的是，A20的细胞保护作用及其潜在机制主要是依据A20过表达实验得到的，后续仍需用A20缺乏的细胞验证其生理上的相关性。

A20的另一功能是具有抗炎作用，过表达的A20可以明显抑制由不同刺激物导致的NF-κB活性。A20可以减少NF-κB靶基因的表达，包括E选择素、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、IL-8、核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor，IκBα)、IL-6。

3 A20的调节机制

调节A20活性的重要机制就是调节A20的表达。调节A20表达有多种不同的方式，其中一种是通过磷酸化调节。当受到TNF或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激时，A20的Ser381位点可被IκB激酶(IKKβ)磷酸化，进一步增加抑制NF-κB信号通路的能力[7]。另外，越来越多的研究表明，生理状态会影响A20的稳定性。在高糖环境下培养的平滑肌细胞中，A20水平依赖于O-糖基化的后转录，后者调节A20的泛素化和降解[8]。也有研究表明，A20能够被可逆氧化反应激活，表明氧化应激和活性氧可能影响细胞的生理状态，进而影响A20水平[9]。A20也可以通过和特殊的结合蛋白结合而发挥抗炎活性。A20结合核因子抑制蛋白(ABIN)和Tax1结合蛋白1(Tax1-binding protein 1，TAX1BP1)是A20的结合蛋白，通过结合多聚泛素来募集A20[10-11]。近年来，非编码RNA在血管损伤中的调控机制越来越受到人们重视，一些研究表明，miRNAs也可以调节A20的表达[12]。有报道表明[13]，miR-19b、miR-29c、miR-23a可以靶向调节A20。在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中，miR-23a表达减少，反而使A20表达增加，从而抑制NF-κB信号。

总之，机体通过不同的机制调节A20的表达和活性来抑制过度的促炎信号。理解这些机制将有助于我们更好的理解A20在组织生理学中的具体作用，帮助我们理解为什么在特定条件下可以发生炎症的病理变化。

4 A20在动脉粥样硬化进程中的作用

4.1A20与血管内皮细胞血管炎症能引起内皮细胞功能失调，抑制内皮凋亡是防止动脉粥样硬化的关键。早先研究证实，A20具有抗炎和抗凋亡的双重保护作用。Longo[14]的研究曾表明，在人的冠状动脉内皮细胞中，A20过表达可以降解IκBα，从而阻断CD40配体所诱导的NF-κB激活，随之下调炎症因子ICAM-1、VCAM-1、E选择素的表达，进而推断A20可以预防修复内皮细胞损伤，减轻动脉粥样硬化病变。A20过表达还能够抑制caspase-8的活性，保护细胞免受死亡受体介导的凋亡，在TNF和Fas等致动脉粥样硬化刺激下，保持线粒体的完整性[15]。近期，Li等[16]的研究也表明，A20可以抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，主要是通过抑制转化生长因子β活化激酶(TGF activation kinase，TAK1)的磷酸化，调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)信号通路来发挥作用。

4.2A20与单核巨噬细胞单核细胞浸润是动脉粥样硬化斑块的主要特征，单核巨噬细胞活化能够释放大量炎症因子，加重炎症反应，从而加剧动脉粥样硬化。LPS可以激活单核巨噬细胞，诱导细胞产生各种炎性因子，引发体内炎症反应。吴丽娟等[17]研究发现，通过转染技术使人单核细胞中A20过表达，LPS对单核细胞的活化被大量抑制，细胞合成并分泌的TNF-α减少，从一个特定角度解释了A20缺陷小鼠对LPS和TNF-α的敏感性异常增高的现象。徐丹等[18]进一步通过阳离子脂质体将A20基因转染入单核细胞，A20过表达可抑制 TNF-α、IL-12的表达，而上调抗炎因子IL-10表达，并通过改善促炎因子/抗炎因子的平衡关系，从而达到抑制炎症反应的作用。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ，ox-LDL)是动脉粥样硬化的一个独立致病因素。巨噬细胞摄取ox-LDL形成泡沫细胞，释放多种促炎介质，促进动脉粥样硬化发生发展。Li等[19]发现，A20表达可以阻断ox-LDL导致的细胞毒性和细胞凋亡，进一步发现，A20减弱Fas和FasL的表达，减少Fas介导的凋亡，其具体机制是通过降低caspase-8活性和线粒体通路来发挥作用。

4.3A20与血管平滑肌细胞在病理状态下，致炎黏附分子和趋化因子的表达增加，能提高平滑肌细胞的活化状态，继而增加平滑肌细胞的增殖，使平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型，基质产物增多，导致内膜增生。因此，抑制新生平滑肌细胞增殖和加速其凋亡都可以达到减轻动脉粥样硬化的作用。A20能加速细胞因子和Fas介导的平滑肌细胞凋亡。在人平滑肌细胞中，A20过表达能明显抑制NF-κB引起的ICAM-1和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)表达；而且A20能明显抑制血管平滑肌细胞增殖，主要是通过上调p21和p27的表达，抑制周期依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase，CDK2)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达，从而调节细胞周期，最终抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖，又通过逆转ox-LDL介导的基质金属蛋白酶表达的升高，阻断平滑肌细胞的迁移[20]。移植物动脉硬化是同种异体移植失败的主要原因，有报道表明[21]，血管A20过表达能明显减少移植物动脉硬化病变，减少移植炎症和增加新生内膜平滑肌细胞凋亡，从而保护血管内膜，降低移植血管损伤，因此，A20能抑制免疫介导的血管同种异体移植物的重构，预防移植血管动脉粥样硬化。

总之，A20发挥抗动脉粥样硬化作用主要表现在以下几方面：A20可以减少内皮细胞活化和功能失调，减少黏附分子的表达；限制免疫细胞的渗透；减少内皮细胞凋亡；抑制平滑肌细胞迁移和增殖。在ApoE-/-小鼠模型中，主动脉弓A20过表达可以改善动脉粥样硬化，相反地，A20单倍体不足可以加重动脉粥样硬化进程。有研究表明，ApoE-/-小鼠中A20单倍体不足可以导致IκBα、VCAM-1、ICAM-1、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor，TRAF-2)等NF-κB靶基因mRNA水平增加，可能是通过不同的信号通路发挥作用的，包括NF-κB信号通路、IL-6可溶性信号传导链(IL-6 soluble transducer, IL-6 ST,又名gp130)介导的IL-6信号通路、MAPK信号通路和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信号通路[22]。因此，A20有望成为治疗动脉粥样硬化的有效潜在靶点。

5 A20与药物调节

二十碳五烯酸作为鱼油中主要的n-3多不饱和脂肪酸，Huang等[23]已证明其具有抗炎特性，可以减少apoE缺乏小鼠的动脉粥样硬化病变。主要机制为上调A20的表达，抑制TRAF6的泛素化和易位，从而抑制下游的TAK1和p38磷酸化，以达到调节NF-κB活性的作用，为动脉粥样硬化和炎症疾病的预防提供新的认识。灵仙新苷是从中药威灵仙中提取的一种三萜皂苷类化合物，Han等[24]研究表明，灵仙新苷可以通过锌指蛋白A20抑制NF-κB、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、ICAM-1、TNF-α、IL-1β等的表达，从而减轻大脑炎症，修复血脑屏障损伤，减轻脑水肿，为与系统性炎症疾病相关的中风提供一种药物治疗。Gui等[25]研究发现，黄芪通过抑制NF-κB信号通路来抑制炎症免疫应答，又进一步通过腺病毒和慢病毒感染和免疫共沉淀等方法得出，黄芪能明显提高A20表达，且通过抑制TRAF6 K63链泛素化阻断NF-κB信号通路，这为我们更好地在细胞和分子水平上分析黄芪或者其他中草药的有效药用成分提供了依据。

6 结语

A20为一种具有双重作用的泛素编辑蛋白，在调节炎症反应和调控凋亡方面具有重要作用。而动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，越来越多的研究资料表明，A20在动脉粥样硬化的防治方面具有一定作用，能够有效地抑制多种刺激因子如NF-κB、ox-LDL 等对动脉粥样硬化的损伤，但其在一些传导通路中的具体的分子机制仍需进一步探讨。随着研究的不断深入，A20有望成为预防和治疗动脉粥样硬化的新靶点。因此，真正了解A20对动脉粥样硬化的保护作用，找到增加其活性的方法，将会在未来的治疗中开辟一条新的途径。

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