微孔草籽油软胶囊急性经口毒性试验和遗传毒性试验

袁 露，仇丽霞，唐晓磊(.山西医科大学 公共卫生学院,太原 03000； .青海省疾控中心，西宁 8000)

微孔草(MicroulasikikimensisHemsl.)系紫草科微孔草属，分布于青藏高原海拨2 000～5 000 m的高寒草甸，是野生珍稀油料植物[1-6]，是获取纯天然，高营养不饱和脂肪酸的又一新途径[7-8]。不饱和脂肪酸一直是学者关注的热点，尤其在调脂、降血压、降血糖、护眼功能等方面有深入的研究[9-11]。不饱和脂肪酸有其强大的生物学活性，而其合成绝大多数依赖于天然油料作物的供给[12-13]。微孔草的综合利用可以加快西部地区的经济发展。

尽管微孔草籽油的安全性已得到证实[14-15]，但由于微孔草籽油软胶囊中添加了其他中草药成分，配伍的安全性有待于研究，且在申报保健食品等高附加值产品前均必须开展此类研究。本文对微孔草籽油软胶囊进行急性经口毒性试验和遗传毒性试验，评价微孔草籽油软胶囊的毒理学安全性问题，以期为人体的合理摄入提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

昆明种小鼠(SPF级)、饲料、垫料、屏障环境均由青海省实验动物中心提供，试验动物生产许可证号：SCXK(青)2005-0001，试验动物使用许可证号：SYXK(青)2005-0001。

1.1.2 原料与试剂

微孔草籽油软胶囊，主要成分为微孔草籽油、石斛和葡萄籽提取物等，0.5 g/粒，白色胶囊，密度0.9 g/mL，由西北高原生物研究所提供，批号20110100。

2-氨基芴，上海研拓生物科技有限公司，批号：20150511；4-硝基喹啉-氮氧化物，上海瑞齐生物科技有限公司，批号：10140701；柔毛霉素，郑州森海化工，批号：20830813；叠氮化钠，湖北兴银河化工有限公司，批号：20111206；丝裂霉素，海正辉瑞制药有限公司，批号：33020786；顺铂，上海瑞齐生物科技有限公司，批号：21110841；环磷酰胺(CP)，上海瀚思化工有限公司，批号：60551920。

1.1.3 仪器与设备

ME-104E电子天平，上海加内特机电设备有限公司；徕卡DM1000生物显微镜，中辉徕博(北京)仪器有限公司；WJ-2-80培养箱，上海跃进仪器有限公司；SHA-2A恒温水浴振荡摇床，常州讯声仪器有限公司；YXQ-LS-100G压力蒸汽消毒锅，上海博讯仪器有限公司；GRX-9023A干热烤箱，上海横琴仪器设备有限公司；DW-86L338低温冰箱，青岛海尔有限公司；XK97-A菌落计数器，济南杰岛分析仪器有限公司；TGL16B低温高速离心机，常州鼎丰仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 急性经口毒性试验和遗传毒性试验

参照GB 15193.1—2003《食品安全性毒理学评价程序》进行急性经口毒性试验、精子畸形试验、骨髓细胞微核试验和Ames试验。

1.2.2 数据统计

采用SPSS13.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性试验

小鼠(SPF级)40只，雌雄各半，随机分为两组，急性经口毒性试验中单次经口给予18 g/kg，喂养14 d，动物无死亡、无明显中毒反应。小鼠急性经口毒性试验前后体重见表1。小鼠体重变化采用重复测量方差分析，结果显示试验组和对照组无统计学差异(F=0.051，P>0.001)；不同性别间体重无统计学差异(F=0.321，P>0.001)；试验前后小鼠体重有差别(F=524.231，P<0.001)，由表1可知，试验后体重增加。按食品急性经口毒性剂量分级标准衡量属无毒级。

表1 小鼠急性经口毒性试验前后体重

2.2 精子畸形试验

昆明种雄性健康小鼠(SPF级)50只，随机分成5组，微孔草籽油软胶囊对小鼠精子的影响见表2。

表2 微孔草籽油软胶囊对小鼠精子的影响

注：0.04(CP)为阳性对照，下同；字母完全不同表示组间LSD-t多重比较在α=0.05的水平上差异显著。

由表2可知，无定形畸形所占比重较大。总的来说，精子畸形率经平方根反正弦变换后采用方差分析得5组间有差异(F=1 487.416，P<0.001)；采用LSD多重比较得5 g/kg组精子畸形率略高于溶剂对照组与低剂量组，10 g/kg组精子畸形率略高于溶剂对照组，不同剂量组间精子畸形率水平较接近，在实验室测定的正常范围内，仍能表明该受试品精子畸形试验结果为阴性；不同剂量组间精子畸形率均低于阳性对照组(t=5.631,P<0.05)。说明该受试物无致突变作用。

2.3 骨髓细胞微核试验

微孔草籽油软胶囊对小鼠骨髓微核细胞的影响见表3。对表3数据进行统计分析，嗜多染红细胞与红细胞比值(PCE/RBC)的比较采用方差分析，性别间有统计学差异，雄性的比值高于雌性(F=7.354，P<0.001)，因结果在本实验室测定值正常范围内，该差异并无实际意义；不同组间有统计学差异(F=11.043，P<0.001)，进一步采用LSD多重比较，不同剂量组间均与阳性对照组有差异(t=4.445,P<0.001)，与溶剂对照组无统计学差异(t=0.223，P>0.001)，受试物不同剂量组间未成熟RBC占RBC总数的比例均不小于溶剂对照组的20%，说明该受试物无致突变作用。微核率采用平方根反正弦变换后进行方差分析，性别间无统计学差异(F=0.525，P>0.001)；不同组间有统计学差异(F=102.928，P<0.001)。进一步采用LSD多重比较，不同剂量组间微核率均与阳性对照组有统计学差异(t=7.839，P<0.001)，与溶剂对照组无统计学差异(t=1.332,P>0.001)，且均在本实验室测定值正常范围内，表明受试品本次试验结果为阴性。

表3 微孔草籽油软胶囊对小鼠骨髓微核细胞影响

2.4 Ames试验

本次试验共设定自发回变组、样品组(分为5个剂量)、溶剂对照组、阳性对照组，每组设定6皿平行皿。微孔草籽油软胶囊对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株试验菌株在加与不加S9时，8个组间菌落数见表4。对表4数据进行统计分析，由于大部分组间菌落数方差不齐，故采用多组比较的秩和检验，结果发现，各菌株无论加不加S9不同组间菌落数均有统计学差异(H=20.055,P<0.001)，采用扩展t检验进行多重比较，5个剂量组、溶剂对照组、自发回变组菌落数均低于阳性对照组(t=9.255,P<0.001)；5个剂量组与自发回变组、溶剂对照组菌落数无统计学差异(t=2.333,P>0.001)，均未超过溶剂对照组和自发回变组菌落数的2倍，也无剂量-反应关系，按照评价程序判定，本次试验结果为阴性，未见其诱变作用。

表4 不同菌株微孔草籽油软胶囊Ames试验结果

3 结 论

微孔草籽油软胶囊对SPF级昆明种小鼠急性经口毒性试验，单次灌胃剂量达18 g/kg,在14 d观察期内动物无死亡、未见明显中毒症状，依据急性毒性分级评价标准规定，该受试品属无毒级；3项致突变试验(精子畸形试验，小鼠骨髓细胞微核试验和Ames试验)结果均为阴性。

[1] 陈志, 索有瑞. 微孔草种籽油对小白鼠血脂水平的影响[J]. 青海医药杂志, 1997(4):12-13.

[2] 李茂言, 何利城, 吴志成.微孔草总油对大鼠实验性高脂血症的防治作用[J]. 中国中药杂志,1999, 24(2):106-108.

[3] 吴素萍.特种油料——微孔草的开发利用现状[J]. 粮油加工, 2009(3):44-46.

[4] 韩发, 程大志, 师生波, 等. 我国优质野生植物微孔草资源的研究与开发利用进展[J]. 中国野生植物资源, 2007，26(5):5-9.

[5] 刘玉萍，吴学明，苏旭, 等. 青海省微孔草资源及开发利用前景[J]. 江苏农业科学, 2006，15(3):37-40.

[6] 马寿福, 刁治民, 邓君, 等. 青海微孔草经济价值及开发利用前景 [J]. 青海草业, 2007, 16(3):37-40.

[7] 曹越, 赵先恩, 索有瑞. 微孔草籽油脂肪酸的HPLC-MS分析[J]. 中国油脂,2010，35(4):72-76.

[8] 吴淑娟, 张一弓, 张丽静, 等. 微孔草Actin基因核心片断的克隆及序列分析[J]. 草业科学, 2010, 27(4):97-101.

[9] TZHANG B S,YANG S F, FU S G, et al. Effect of dietary flaxseed on cholesterol metabolism of hamsters[J]. Food Chem,2009,114(4):1450-1455.

[10] NGUYEN C T, BUI B V, SINCLAIR A J, et al. Dietaryomega-3 fatty acid decrease intraocular pressure with age by increasing aqueous outflow[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48:756-762.

[11] PINHERO M N Jr, DOS SANTOS P M, DOS SANTOS R C, et al. Oral flaxseed oil(Linumusitatissimum) in the treatment for dry-eye Sjogren’s syndrome patients[J]. Arq Bras Talmol, 2007,70:649-655.

[12] 郑秋甫.Omega-3多不饱和脂肪酸的研究进展[J]. 中华保健医学, 2011，13(5):357-360.

[13] 高宗颖, 苏丽, 袁丽, 等. 多不饱和脂肪酸的应用[J]. 农业工程技术， 2011(2):39-41.

[14] 陈建国, 来伟旗, 梅松, 等. 微孔草籽油的安全性评价[J]. 毒理学杂志, 2008，22(1):79-80.

[15] 郭红云, 梁涛，张永东，等. 微孔草籽油对大鼠胚胎毒性和致畸作用研究[J]. 中国康复理论与实践，2009，15(12)： 1135-1137.