粉碎处理对水酶法提取花生营养成分及其组成影响规律研究

李宇健，陈复生，郝莉花，夏义苗，赵自通(河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

水酶法的原理是采用能降解油料植物细胞壁，或对脂蛋白、脂多糖等大分子复合物具有水解作用的酶来处理油料，破坏其组织结构、水解大分子复合体，并利用非油成分对水和油亲和力不同以及水油的密度差将油脂和蛋白质分离出来[1]。花生中的主要成分为油脂和蛋白质，其子叶的含油细胞中储存着花生的脂肪和蛋白质。花生中油脂的存在形式为直径0.1 μm的油脂体，蛋白质的存在形式为直径2～10 μm 的蛋白体亚细胞[2]。因此，在水酶法工艺中，油料的粉碎程度对提高油料有效成分的得率起着重要作用。采用机械粉碎，最大程度破坏油料细胞，作为水酶法预处理工艺十分关键[3]。机械粉碎可降低油料的粒度、破坏油料的细胞壁，使细胞内有效成分易于释放，有利于物料与酶接触面积的增加，提高酶的作用效果[4]。

朱凯艳等[5]研究花生粉碎程度对花生水酶法提取油脂和水解蛋白得率以及提油过程所得乳状液稳定性的影响，用蛋白酶提取花生水解蛋白和油脂，得率分别为77.5%和88.8%。但目前使用纤维素酶对粉碎处理后花生营养成分及组成影响规律的研究鲜有人探讨。本试验使用纤维素酶研究花生粉碎程度对水酶法提取油脂和蛋白质的影响，利用高效液相色谱和气相色谱分析比较花生中氨基酸、α-维生素E和花生油中脂肪酸含量的变化规律，分析粉碎程度对花生营养成分的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

花生购于郑州市丹尼斯超市，去壳后贮存于4℃冰箱待用。37种脂肪酸甲酯混标，上海安谱公司；异辛烷、氢氧化钠、甲醇，色谱纯；纤维素酶，丹麦诺维信(中国)有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BT-9300H激光粒度分布仪；Waters2695高效液相色谱仪，配Waters 氨基酸分析包，美国沃特斯公司；Agilent 6890N气相色谱仪，配FID检测器，SP-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；纯净仪，美国默克密理博公司；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱；FW-100型高速万能粉碎机；BSA224S-CW型分析天平；THZ-82型数显水浴恒温振荡器；K1100全自动凯氏定氮仪；FM200均质机；TDL-5-A型低速离心机；LGJ-25型冷冻干燥机；DZF-2B型真空干燥箱。

1.2 试验方法

1.2.1 主要成分测定

水分含量测定：参照GB/T 5009.3—2003测定；粗脂肪含量测定：参照GB/T 5009.6—2003测定；粗蛋白质含量测定：参照GB/T 5009.5—2003测定；灰分含量测定：参照GB/T 5009.4—2003测定。

1.2.2 不同方式粉碎去皮花生

将去皮花生以两种方式粉碎，第一种是将去皮花生粉碎1～7次，每次的粉碎时间为2 s(±0.5 s)；第二种是将去皮花生粉碎不同时间，2 s递增，粉碎时间分别为2～14 s(±0.5 s)。

1.2.3 花生粉碎后粒径的测定

取0.5 g粉碎后的花生，放置于50 mL去离子水中。常温振荡20 min使粉碎的花生均匀分散在液体中。将料液滴入激光粒度分布仪的样品池中进行测定，得出体积平均粒径。

1.2.4 花生粉碎后脂肪酸含量变化测定

参照GB 5009.168—2016，将粉碎的花生用索氏提取装置提取油脂，并用旋转蒸发器挥干残留的有机溶剂，过程中充氮气保护。将提取的油脂用2%氢氧化钠甲醇溶液于80℃±1℃水浴上回流甲酯化，直至油滴消失，再加入15%三氟化硼甲醇溶液继续回流2 min，此过程中充氮气保护。甲酯化结束后，加入正庚烷和饱和氯化钠水溶液，静置分层，取上层正庚烷层，并用无水硫酸钠脱除水分。取正庚烷提取液上Agilent 6890N气相色谱仪测定脂肪酸组成。

1.2.5 花生粉碎后氨基酸含量变化测定

按照GB 5009.124—2016的方法测定。称取粉碎后的花生2～5 g于水解管中，加入盐酸4 mL(12 mol/L)，在110℃水解22 h，用高效液相色谱仪分析氨基酸组成。

1.2.6 花生粉碎后α-维生素E含量变化测定

按照GB/T 5009.82—2003的方法测定。准确称取1～10 g粉碎花生，置于皂化瓶，加30 mL无水乙醇搅拌使其分散均匀。加5 mL 10%抗坏血酸，苯并芘标准液2.00 mL，混匀。加入10 mL氢氧化钾，混匀。于沸水浴回流30 min使其完全皂化。皂化后立即放入冰水中冷却。将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50 mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100 mL乙醚分2次洗涤皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。用约50 mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性。后经浓缩取上清液供液相色谱分析。

色谱条件：SinoChrom Si60色谱柱(5 μm，4.6 mm×25 cm)；流动相为98%甲醇和2%水；流速为1.7 mL/min；RF-510LC检测器波长300 nm；进样量20 μL。

1.2.7 水酶法提取花生油和蛋白质

称取20 g不同粉碎方式的去皮花生，加入100 mL 的去离子水，用均质机均质使花生原料均匀分散在液体中，按20 U/g向原料中加入纤维素酶，50℃振荡酶解2 h，后将料液离心(20 min，4 000 r/min)，分离得到油、乳状液、蛋白水解液和渣。

1.2.8 数据统计

试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，不同处理组采用One-Way方差分析(ANOVA)和Duncan’s multiple range tests(P<0.05)分析方法进行差异显著性分析，数据表示为“平均值±标准偏差”。

2 结果与讨论

2.1 花生的主要成分

去皮花生的主要成分分析结果如表1所示。由表1可知，在去皮花生中，粗脂肪和粗蛋白质的含量占花生总质量的75%以上。

表1 去皮花生的主要成分 %

2.2 粉碎次数与粉碎时间对粒径的影响

花生体积平均粒径与粉碎次数和粉碎时间的关系如图1所示。

图1 花生体积平均粒径与粉碎次数和粉碎时间的关系

由图1(A)可知，粉碎花生的体积平均粒径随着粉碎次数的增加逐步降低，前4次的粉碎花生体积平均粒径迅速降低，从60 μm降低至27 μm。之后粉碎花生体积平均粒径下降速度减缓，第7次粉碎后，粉碎花生花体积平均粒径降低到19 μm。由图1(B)可知，随着粉碎时间的延长，8 s以前粉碎花生的体积平均粒径持续下降，与图1(A)有相似的趋势，8～12 s粉碎花生的体积平均粒径降低趋势减缓。物料粉碎通常用物理方法来克服物料内部的结合力，使其破碎达到一定粒度。根据原料和成品颗粒粒度，粉碎可分为粗粉碎、细粉碎、微粉碎和超微粉碎4种类型(见表2)。由表2可知，本试验的粉碎类型属于微粉碎。

表2 粉碎类型[6]

对比两种粉碎方法，在粉碎条件、累积时间相同的情况下，两种粉碎花生的体积平均粒径分布无明显差别。花生中的油脂和蛋白质主要集中于长70 μm、宽40 μm的花生子叶含油细胞中，粉碎时间短会造成粉碎的花生颗粒不均匀，有大量未被破碎的颗粒。在使用纤维素酶进行水酶法提取花生中油脂和蛋白质的过程中，粉碎花生的粒径过大或过小都会产生影响，粉碎颗粒过大，纤维素酶能接触的作用位点少；反之，粉碎颗粒过小，纤维素酶对花生细胞壁的作用对提取率的影响就会减小而变得不明显，而且会使乳化现象加重，不利于提高提取率。

2.3 粉碎时间对残油率和蛋白质得率的影响

粉碎时间对蛋白质得率和残油率的影响如图2所示。

注：图中标有不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

图2不同粉碎时间对残油率和蛋白质得率的影响

由图2(A)可知，随着粉碎时间的延长，花生渣中的残油率持续降低。在粉碎初期，花生渣中的残油率很高，这是因为粉碎的花生颗粒粒径过大，导致渣中还有大颗粒的花生原料，其中的油脂没有通过水酶法的作用被释放出来。在粉碎时间为10 s时，粉碎花生的体积平均粒径减小到32 μm左右，此时花生渣的残油率较低，为14.8%。

水酶法提油的同时能得到高质量的蛋白质。由图2(B)可知，随着粉碎时间的延长，蛋白质得率出现了先升高后降低的趋势，在粉碎时间为10 s时，蛋白质得率达到最高，为70.5%，蛋白质得率增加最大幅度在粉碎时间为4～6 s时，即粉碎花生体积平均粒径从48 μm降低到40 μm。粉碎时间超过10 s后，蛋白质得率有些许下降，这证明了粉碎花生的体积平均粒径进一步减小时，花生含油细胞中的油脂体被破碎，油脂释放出来与蛋白质在水相发生乳化现象，所以蛋白质得率下降，同时增加了乳状液破乳的难度，这也会影响油脂的得率。

2.4 粉碎时间对脂肪酸的影响

油脂中的脂肪酸决定了油脂主要的营养功能，花生油中不饱和脂肪酸含量很高，其中主要是油酸(C18∶1)和亚油酸(C18∶2)，还有少量的花生烯酸(C20∶1)、棕榈油酸(C16∶1)、亚麻酸(C18∶3)。饱和脂肪酸主要为棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生酸(C20∶0)、山嵛酸(C22∶0)、木焦油酸(C24∶0)。以花生油中主要的3种不饱和脂肪酸(C18∶1、C18∶2、C20∶1)总和与主要的4种饱和脂肪酸(C16∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0)总和的变化反映粉碎时间对花生油中脂肪酸含量变化的影响。粉碎时间对花生油中脂肪酸含量的影响规律如表3所示。

表3 不同粉碎时间对花生油中主要脂肪酸含量的影响

由表3可知，随着粉碎时间由2 s延长到12 s，花生油生饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都有微弱的下降趋势，饱和脂肪酸含量下降了8.4%，不饱和脂肪酸含量下降了4.4%。花生油中含有的反式脂肪酸是反式油酸、反式亚油酸，其含量随着粉碎时间由 2 s 延长至12 s，增加了140%。这可能是因为粉碎后的花生含油细胞破裂而释放油脂，油脂与氧气接触，脂肪酸发生氧化反应，导致脂肪酸含量下降。因此，在花生粉碎时，粉碎时间不宜过长。反式脂肪酸含量升高可能是因为粉碎过程中粉碎机高速旋转，使得粉碎花生温度升高。在高温条件下发生不饱和脂肪酸异构化，主要是由于活化能的热能作用下使顺式结构发生异构化[7]。许多研究表明大量食用含反式脂肪酸的食物会加速动脉粥样硬化，容易导致心脑血管疾病、冠心病、糖尿病和老年痴呆等疾病[8]。

2.5 粉碎时间对氨基酸的影响

Monteiro等[9]研究表明，花生各组分蛋白质均含有18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸。其中总蛋白中半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸含量低，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸含量较高。粉碎时间对花生中氨基酸含量的影响规律如表4所示。

表4 不同粉碎时间对花生中主要氨基酸含量的影响

注：同行标有不同字母表示差异显著(P<0.05)。

由表4可知，随着粉碎时间的延长，6种主要氨基酸的含量都有不同程度下降，其中丝氨酸下降最多，粉碎时间14 s与粉碎时间4 s时比，丝氨酸含量从14.65 mg/g下降到9.95 mg/g，降低了32.1%。在粉碎时间从4 s延长到6 s时，除了亮氨酸外其他几种主要氨基酸的含量都有显著的下降。天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸在粉碎时间从6 s延长到8 s时，含量也都有显著的下降，各主要氨基酸含量在 8 s 后下降的趋势变缓。花生中氨基酸总量随粉碎时间的变化如图3所示。

由图3可知，氨基酸总量随着粉碎时间的延长逐步下降，由307.5 mg/g降低到269.9 mg/g，下降了12.2%。粉碎时间由4 s延长到6 s时氨基酸总量下降趋势显著。这可能是随着粉碎花生粒径逐步降低，花生蛋白中的氨基酸受到物理作用力的影响，氨基酸结构被破坏进而其含量降低。有研究表明随着温度的升高，天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸含量会降低[10]。

图3 花生中氨基酸总量随粉碎时间的变化

2.6 粉碎时间对α-维生素E含量的影响

维生素E是人体必须从外界获取的必要维生素之一，对于植物本身具有提高其抗氧化性、延长种子寿命的作用[11]，但是粉碎过程是否会对其含量产生影响，目前研究报道较少。粉碎时间对花生中α-维 生素E含量的影响如表5所示。

表5 不同粉碎时间对花生中α-维生素E含量的影响

由表5可知，花生中α-维生素E含量随着粉碎时间的延长而升高，但升高的幅度很小。这可能是粉碎处理使得α-维生素E更容易被释放出来。鞠阳[12]研究发现，微波处理后油料中的维生素E含量有一定程度的升高。甘晓露等[13]研究发现，随着烘烤温度的升高(130～220℃)，水酶法提取的花生油中的α-维生素E含量先呈现下降趋势，而后随着温度升高逐渐上升。

3 结 论

使用小型高速万能粉碎机粉碎去皮花生，相同粉碎时间情况下单次和多次粉碎的花生体积平均粒径没有显著区别。粉碎花生体积平均粒径随着粉碎时间的延长而减小，粉碎时间为10 s时，粉碎花生体积平均粒径下降到32 μm左右，此时蛋白质得率达到最高，为70.5%，残油率较低，为 14.8%。继续延长粉碎时间，粉碎花生体积平均粒径过小会导致乳化现象加重，蛋白质得率出现降低的趋势。

随着粉碎时间的延长，花生油中脂肪酸和花生中氨基酸发生氧化，粉碎时间由2 s延长到12 s时花生油中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量分别下降了8.4%和4.4%，反式脂肪酸含量增加了140%；α-维 生素E含量略微升高。综合考虑，当粉碎时间为10 s，粉碎花生体积平均粒径达到32 μm左右时，花生中营养物质的损失相对较小，适合作为最优的粉碎条件用于水酶法提取花生油和蛋白质的研究。

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