失神经性肌萎缩动物模型制备方法的研究进展①

赵丹丹，唐成林，黄思琴，罗翱，张安宁，安荟羽，吴梦佳，谭程方

1.重庆医科大学中医药学院，重庆市400016；2.中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆市400016

骨骼肌是周围神经的靶器官。神经长期受损后，靶肌肉会发生不可逆性肌萎缩；即使之后再行显微外科术缝合神经，靶肌肉功能活动依旧不能完全恢复。

失神经肌萎缩的调控机制复杂，蛋白质的分解合成水平失衡、肌细胞凋亡增加、肌卫星细胞池耗竭等均参与其中[1-2]，这些机制又受多种信号通路调控[3]。针灸、推拿能有效延缓失神经肌萎缩，为神经再生修复提供良好肌肉条件[4-5]，但其作用机制尚未完全阐明。

神经损伤的部位和程度不同，靶肌肉萎缩程度不同。造模方法的选择和优化对深入探讨针灸、推拿延缓失神经性肌萎缩的相关机制十分重要。

1 外源性神经损伤模型

多种外源性理化刺激均可诱导神经损伤后靶肌肉失神经肌萎缩，常见的有手术损伤、物理因素损伤和化学因素损伤。实验对象以小型啮齿类动物(大鼠、小鼠、家兔等)为主，多以靶肌肉的肌湿重比、肌纤维截面积或纤维直径的下降作为判断造模成功的标准[4-6]。

1.1 手术损伤

外源性神经损伤所致失神经肌萎缩的动物模型中，应用最多且最被承认的是手术机械性损伤模型。损伤部位多为粗大的周围神经干、神经丛根部或脊髓。

1.1.1 周围神经干损伤

此类模型多选择损伤周围神经主干(如坐骨神经)或其较大分支(如胫神经、腓总神经等)；损伤方式常见横断伤、急性钳夹伤、慢性卡压伤。神经损伤程度可根据Sunderland[7]提出的神经损伤Ⅴ度分类法进行评估。

1.1.1.1 横断伤

Huang等[8]于大鼠右侧坐骨结节处行手术切口，分离臀大肌和股二头肌后暴露坐骨神经，于梨状肌下缘切除坐骨神经长约3～5 mm，将神经两断端翻转180°后缝合于邻近组织。造模后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d，模型组腓肠肌湿重比、纤维截面积及直径均进行性减小，提示造模成功。横断坐骨神经主干可造成SunderlandⅤ度损伤；将神经断端固定以防止侧支吻合发生，较仅横断坐骨神经而不固定断端的造模方法[9]更为严谨。

有研究者认为，离断坐骨神经主干会诱发对侧肢体代偿性肥大，导致实验结果偏差，他们主张通过离断坐骨神经下游分支(如胫神经[4]或腓总神经[10])制备失神经肌萎缩模型，手术入路和方法均与前者相似。Su等[4]以胫神经离断小鼠为模型，发现电针能通过调控生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)及肌肉生长抑素(myostatin,MSTN)信号通路相关蛋白的表达，促进肌肉再生，延缓失神经肌萎缩。

离断周围神经的模型均能较好模拟神经横断伤后靶肌肉不可逆性萎缩的病理机制，且操作简便，重复性好，损伤程度较为统一，便于定量分析，适用于针灸、推拿延缓下肢失神经肌萎缩机制的长期研究。

1.1.1.2 急性钳夹伤

Wu等[11]以12.5 cm长的显微外科止血钳钳夹大鼠坐骨神经3次，每次10 s，间隔10 s。造模后0 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d，模型组坐骨神经功能指数(sciatic functional index,SFI)逐渐回升，腓肠肌湿重比及纤维截面积先下降后升高。但该实验并未说明神经的损毁程度。

周岚等[12]以14 cm长的止血钳全齿钳夹腓总神经3次，每次10 s，间隔10 s，损伤宽度5 mm。术后损伤处神经丝蛋白荧光信号完全消失，表明轴突完全断裂，提示造成腓总神经SunderlandⅡ度损伤。

Gigo-Benato等[13]以无齿钳予胫神经约54 N压迫，持续30 s，造成3×2 mm损伤区，术后2周病理学和功能学指标[12-13]证实造模成功。

Pan等[14]以无齿钳钳夹大鼠坐骨神经30 s，发现电针干预能通过调控腓肠肌中组织纤维蛋白溶酶原激活质(tissue plasminogen activator,tPA)及其抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的表达，促进神经修复，延缓失神经肌萎缩。

与神经横断伤相比，钳夹坐骨神经主干或其分支可造成SunderlandⅡ～Ⅲ度损伤，损伤程度较轻，神经损伤后可再生修复，靶肌肉萎缩可逆，能较好模拟神经急性钳夹伤后靶肌肉萎缩的病理机制，适用于针灸、推拿延缓下肢失神经肌萎缩的短期研究。目前该类型造模方法仍存在缺点：钳夹器材的规格、型号，压迫神经的力度、时间、间隔，反复压迫的位点等不同，会导致神经损伤程度不同，较难进行统一定量分析。

1.1.1.3 慢性卡压伤

周围神经慢性卡压伤临床极为常见。基础研究多通过结扎坐骨神经模拟慢性卡压伤，探讨神经病理性疼痛的相关机制[15]。车光昇等[16]用外科缝合线双重结扎大鼠左侧坐骨神经，术后4周，模型组术侧骨骼肌纤维截面积及直径较正常组减小，提示造模成功。但该模型并未介绍卡压神经所用缝线的规格、材质，以及结扎神经的力度，且未进行神经损伤程度评估。

1.1.2 神经丛根部损伤

此类模型多选择臂丛神经，手术入路有前入路和后入路，损伤方式多为根部撕脱伤，用以模拟临床分娩性臂丛神经损伤。目前研究多集中于神经性疼痛及神经修复方面[17]。

潘峰[18]取锁骨下路行右锁骨上-颈部联合切口，暴露位于前中斜角肌肌间隙内的臂丛神经干根部，行C5～T1全臂丛神经根撕脱术。术后1周、5周、10周、15周，大鼠前肢爪内肌与肱二头肌纤维截面积维持率逐渐下降，术后5周靶肌肉中运动终板荧光强度明显减弱，提示造模成功。该实验通过改良前入路法行全臂丛撕脱术，引起术侧上肢不可逆性肌萎缩，较好模拟分娩性臂丛神经损伤的病理机制，较后入路法可靠性强、创伤小、成功率高。

1.1.3 脊髓损伤

此类模型多选择损伤胸腰段脊髓节段，损伤方式多见冲击伤和横断伤。与上述造模方式相比，具有损伤严重程度高、术中出血量大、动物存活率低的特点。

1.1.3.1 横断伤

Wu等[19]剥除大鼠椎板，暴露T9-10脊髓节段，显微手术剪在T10节段横断脊髓。术后14周，模型组比目鱼肌及股四头肌湿重比降低，提示造模成功。Zhang等[20]以横断T10节段脊髓的大鼠为模型，发现电针能通过调控神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的表达，保护运动神经元，延缓失神经肌萎缩。

上述模型能较好模拟低位截瘫的病理机制，损伤程度易于量化，适用于针灸、推拿对低位截瘫的长期疗效研究。但因模型损伤程度重，对术后动物的护理要求较高。

1.1.3.2 急性撞击伤

Wei等[21]剥除大鼠椎板暴露脊髓节段，将10 g金属棒从12.5 mm高度自由下落，造成T10节段脊髓损伤。术后0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d，模型组脊髓损伤BBB评分逐渐回升，术后7 d和14 d比目鱼肌纤维直径较假手术组减少，提示造模成功。

Bramlett等[22]以T10节段急性撞击伤大鼠为模型，发现低频振动虽不能延缓失神经性肌萎缩，但可通过上调Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)等因子表达，减少骨质丢失。

此种模型通过重物打击造成脊髓急性钝挫伤，使损伤平面以下出现可逆性失神经肌萎缩。与脊髓横断伤相比，具有损伤程度轻、动物存活率高的优点。但存在重物下落点易偏移、模型不易量化的缺点。

还有研究者[23]通过建立神经损伤再修复模型，研究神经再支配后靶肌肉萎缩及恢复的相关机制。该模型对神经断端的状态要求较高，对神经吻合的操作技术要求亦高，神经缝合后恢复程度难以进行统一量化分析，较少应用。

1.2 物理因素损伤

除手术外，亦有研究者应用其他物理因素损伤神经，制备失神经肌萎缩模型。

Tamaki等[24]分离出大鼠坐骨神经，将直径5 mm的不锈钢棒从液氮中取出，立即置于坐骨神经上5 s。术后予电刺激。结果显示，模型组胫前肌、趾长伸肌和比目鱼肌湿重比及胫前肌纤维截面积减少，提示造模成功；电刺激能有效延缓骨骼肌中毛细血管消退，进而延缓失神经性肌萎缩。

液氮冻伤可造成SunderlandⅣ度损伤(神经外膜存在而神经内部结构完全断裂)，从而保证神经损毁程度基本一致，方便定量研究。但该造模方法对实验条件要求较高，操作中对动物的护理要求较高，且因液氮易造成周围软组织急性冻伤，不符合临床失神经肌萎缩的病理机制，较少应用。

徐鹏等[25]利用高强度聚焦超声精确定位并损伤坐骨神经：将新西兰大白兔实验侧腿全部浸于蓄水池中并固定，超声治疗头对准膝关节平面以上1.5 cm处，8.5 MHz B型超声显示坐骨神经，JC型聚焦超声治疗系统辐照。造模1周、2周、4周，辐照侧腓肠肌及比目鱼肌湿重、腓肠肌纤维截面积和直径逐渐减小；辐照侧坐骨神经出现黏液样、空泡样变性，提示造模成功。该实验未进行神经损伤程度评估。

该造模方法具有创伤小、操作简便、定位准确的优点，但因所需实验条件较高，且不符合临床失神经肌萎缩的病理特点，较少应用。

1.3 化学因素损伤

臀肌注射引起的医源性坐骨神经损伤是全球性问题，尤以发展中国家多见。许多药物具有神经毒性，一旦累及神经，将引发下肢肌萎缩甚至肢体残疾。

Yu等[26]分离、暴露大鼠坐骨神经，用4号针头将20万U青霉素钠(0.5 ml)注射于神经干偏外侧外膜下，术后予电针干预。结果表明，损伤后1周、2周、4周、6周，大鼠SFI逐渐回升，胫前肌湿重及纤维截面积先减少后增加，提示造模成功；电针干预可能通过调控胫前肌中聚集蛋白(agrin)、成熟型乙酰胆碱受体(acetylcholine receptorεsubunit,AChR-ε)和胚胎型乙酰胆碱受体(acetylcholine receptorγsubunit,AChR-γ)的表达，促进神经肌接头再生修复，延缓失神经肌萎缩。

造模过程中应注意避免因药液渗漏引起而造模程度的不同。

2 内源性神经病变模型

神经自身病变也可引起靶肌肉神经源性损害，如肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、脊肌萎缩症、进行性延髓麻痹等，发病原因尚不明确。目前基础研究中，应用最多的是ALS模型，实验动物多选择小鼠。

ALS是一种慢性渐进性疾病，主要由于上/下运动神经元退行性障碍导致神经元死亡，出现渐进性四肢乃至全身肌肉无力、萎缩，并伴有锥体束征[27]。多种超氧化物歧化酶-1(type-1 superoxide dismutase,SOD-1)基因突变被证明与ALS相关，且以G93A位点突变多见。将人突变的hSOD1G93A基因转导入B6SJL小鼠(雌性C57BL/6小鼠和雄性SJL小鼠的杂交后代)是目前公认的ALS转基因动物模型。这类小鼠通常在出生3个月后开始出现进行性加重的ALS样症状[28]，多以肢体抓握力、抓握时间，腓肠肌最大收缩力等指标评估其肌无力程度。

Cai等[29]对14周龄ALS小鼠予蜂毒针干预，结果表明，蜂毒针能通过调控股四头肌中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、B细胞淋巴瘤2因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和脊髓中Toll样受体-4(Toll-like receptors 4,TLR-4)等因子表达，保护运动神经元，减轻骨骼肌炎性反应，延缓肌萎缩。

此类转基因动物为探讨针灸、推拿延缓ALS的机制奠定了基础。

3 总结与展望

目前，损伤周围神经和脊髓是建立失神经性肌萎缩模型的主要方法。Shahidi等[30]的研究表明，大脑皮质损伤后，参与骨骼肌失神经萎缩的调控机制更加复杂。选择符合临床实际的失神经肌萎缩动物模型、进行模型优化及统一定量分析，对今后探讨针灸、推拿延缓失神经肌萎缩的机制至关重要。

除原发性失神经损伤外，其他多种诱因，如制动、疾病、衰老等，也可通过影响骨骼肌的营养代谢引起肌萎缩。目前较多研究着眼于以下几种类型肌萎缩：废用性肌萎缩[31]、失重性肌萎缩[32]、Duchenne肌营养不良[33]、衰老性肌减少症[34]、药源性肌萎缩[35]、癌症恶病质性肌萎缩[36]，因糖尿病[37]、各种器官衰竭(心[38]、肺[39]、肾[40])等疾病状态引起的肌萎缩等。这些实验研究为探讨针灸、推拿延缓相应生理病理状态下肌萎缩的机制提供了新的思路。

[1]Lang F,Aravamudhan S,Nolte H,et al.Dynamic changes in the skeletal muscle proteome during denervation-induced atrophy[J].Dis Model Mech,2017,10(7):881-896.

[2]Agüera E,Castilla S,Luque E,et al.Denervated muscle extract promotes recovery of muscle atrophy through activation of satellite cells.An experimental study[J].J Sport Health Sci,2017.[Epub ahead of print].doi:10.1016/j.jshs.2017.05.008.

[3]Zhou J,Liu B,Liang C,et al.Cytokine signaling in skeletal muscle wasting[J].Trends Endocrinol Metab,2016,27(5):335-347.

[4]Su Z,Hu L,Cheng J,et al.Acupuncture plus low-frequency electrical stimulation(Acu-LFES)attenuates denervation-induced muscle atrophy[J].JAppl Physiol,2016,120(4):426-436.

[5]郭汝宝,严隽陶,张喜林,等.推拿手法对骨骼肌失神经后卫星细胞增殖与IGF-Ⅰ表达影响的实验研究[J].中华中医药学刊,2013,31(9):1872-1874.

[6]Moresi V,Williams AH,Meadows E,et al.Myogenin and class II HDACs control neurogenic muscle atrophy by inducing E3 ubiquitin ligases[J].Cell,2010,143(1):35-45.

[7]Sunderland S.A classification of peripheral nerve injuries producing lossof function[J].Brain,1951,74(4):491-516.

[8]Huang QK,Qiao HY,Fu MH,et al.MiR-206 attenuates denervation-induced skeletal muscle atrophy in rats through regulation of satellite cell differentiation via TGF-β1,Smad3,and HDAC4 signaling[J].Med Sci Monit,2016,22:1161-1170.

[9]韩利军,梁炳生,王乐,等.失神经骨骼肌萎缩中泛素蛋白连接酶Murf1和核转录因子NF-κB表达与被动运动干预[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(24):4435-4438.

[10]杨绍安,靳安民,蔡宝塔,等.酸性成纤维细胞生长因子预防失神经支配肌运动终板退变及肌萎缩的实验研究[J].中华显微外科杂志,2006,29(3):213-214.

[11]Wu R,Yan Y,Yao J,et al.Calpain 3 expression pattern during gastrocnemius muscle atrophy and regeneration following sciatic nerve injury in rats[J].Int JMol Sci,2015,16(11):26927-26935.

[12]周岚,吴颢昕,梅晓云.补阳还五汤延缓大鼠胫前肌失神经肌萎缩的基因筛选[J].中草药,2014,45(4):516-522.

[13]Gigo-Benato D,Russo TL,Geuna S,et al.Electrical stimulation impairs early functional recovery and accentuates skeletal muscle atrophy after sciatic nerve crush injury in rats[J].Muscle Nerve,2010,41(5):685-693.

[14]Pan F,Yu T,Wong S,et al.Chinese Tuina downregulates the elevated levels of tissue plasminogen activator in sciatic nerve injured Sprague-Dawley rats[J].Chin JIntegr Med,2017,23(8):617-624.

[15]Chen XM,Xu J,Song JG,et al.Electroacupuncture inhibits excessive interferon-γevoked up-regulation of P2X4 receptor in spinal microglia in a CCIrat model for neuropathic pain[J].Br JAnaesth,2014,114(1):150-157.

[16]车光昇,郭源秩,宋光熠.神经源性肌萎缩病理动物模型的制备[J].辽宁医学杂志,2014,28(5):301.

[17]Zhang S,Tang H,Zhou J,et al.Electroacupuncture attenuates neuropathic pain after brachial plexus injury[J].Neural Regen Res,2014,9(14):1365-1370.

[18]潘峰.大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌microRNA表达差异以及正常大鼠肱二头肌与前肢爪内肌神经肌肉接头出生后发育差异[D].上海:复旦大学,2014.

[19]Wu Y,Collier L,Qin W,et al.Electrical stimulation modulates Wnt signaling and regulates genes for the motor endplate and calcium binding in muscle of rats with spinal cord transaction[J].BMC Neurosci,2013,14(1):81-95.

[20]Zhang YT,Jin H,Wang JH,et al.Tail nerve electrical stimulation and electro-acupuncture can protect spinal motor neurons and alleviate muscle atrophy after spinal cord transection in rats[J].Neural Plast,2017,2017:7351238.

[21]Wei ZJ,Zhou XH,Fan BY,et al.Proteomic and bioinformatic analyses of spinal cord injury induced skeletal muscle atrophy in rats[J].Mol Med Rep,2016,14(1):165-174.

[22]Bramlett HM,Dietrich WD,Marcillo A,et al.Effects of low intensity vibration on bone and muscle in rats with spinal cord injury[J].Osteoporos Int,2014,25(9):2209-2219.

[23]Romeo-Guitart D,Forés J,Navarro X,et al.Boosted regeneration and reduced denervated muscle atrophy by neuroheal in a pre-clinical model of lumbar root avulsion with delayed reimplantation[J].Sci Rep,2017,7(1):12028-12040.

[24]Tamaki H,Yotani K,Ogita F,et al.Electrical stimulation of denervated rat skeletal muscle ameliorates bone fragility and muscle loss in early-stage disuse musculoskeletal atrophy[J].Calcif Tissue Int,2017,100(4):420-430.

[25]徐鹏,王涛,冯露,等.高强度聚焦超声建立骨骼肌失神经萎缩动物模型的研究[J].重庆医科大学学报,2010,35(1):48-50.

[26]Yu J,Wang M,Liu J,et al.Effect of electroacupuncture on the expression of agrin and acetylcholine receptor subtypesin ratswith tibialisanterior muscular atrophy induced by sciatic nerve injection injury[J].Acupunct Med,2017,35(4):268-275.

[27]刘焕彩,丁昊宇,王箐,等.Cyclin D1在肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠大脑皮层和海马中的表达[J].神经解剖学杂志,2017,33(4):423-429.

[28]Hwee DT,Kennedy A,Ryans J,et al.Fast skeletal muscle troponin activator tirasemtiv increases muscle function and performance in the B6SJL-SOD1G93A ALS mouse model[J].PLoS One,2014,9(5):e96921.

[29]Cai MD,Choi SM,Yang EJ.The effects of bee venom acupuncture on the central nervous system and muscle in an animal hSOD1G93A mutant[J].Toxins,2015,7(3):846-858.

[30]Shahidi B,Shah SB,Esparza M,et al.Skeletal muscle atrophy and degeneration in a mouse model of taumatic brain injury[J].JNeurotrauma,2017.[Epub ahead of print].doi:10.1089/neu.2017.5172.

[31]Li TS,Shi H,Wang L,et al.Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on satellite cell proliferation and apoptosis in immobilization-induced muscle atrophy in rats[J].Med Sci Monit,2016,22:4651-4660.

[32]李洋.不同配伍比例的黄芪当归药对对废用性肌萎缩的影响[D].西安:西北大学,2015.

[33]Whitehead N,Kim M,Bible K,et al.Simvastatin improvesphysiological function and protects against muscle degeneration in MDX mice:A novel therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy[J].Neuromuscul Disord,2015,41(112):12864-12869.

[34]Kou X,Li J,Liu X,et al.Ampelopsin attenuates the atrophy of skeletal muscle from D-gal-induced aging rats through activating AMPK/SIRT1/PGC-1αsignaling cascade[J].Biomed Pharmacother,2017,90:311-320.

[35]翟玉莹,李青南,刘洋,等.地塞米松诱导近交系和封闭群Wistar大鼠骨骼肌萎缩效应比较[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2017,10(1):58-65.

[36]Sun R,Zhang S,Hu W,et al.Valproic acid attenuates skeletal muscle wasting by inhibiting C/EBPβ-regulated atrogin1 expression in cancer cachexia[J].Am JPhysiol Cell Physiol,2016,311(1):C101-C115.

[37]El-Lithy GM,El-Bakly WM,Matboli M,et al.Prophylactic L-arginine and ibuprofen delay the development of tactile allodynia and suppress spinal miR-155 in a rat model of diabetic neuropathy[J].Transl Res,2016,177:85-97.

[38]Damatto RL,Martinez PF,Lima ARR,et al.Heart failure-induced skeletal myopathy in spontaneously hypertensive rats[J].Int JCardiol,2013,167(3):698-703.

[39]Qi Y,Shang J,Ma L,et al.Inhibition of AMPK expression in skeletal muscle by systemic inflammation in COPD rats[J].Respir Res,2014,15(1):156-165.

[40]Wang DT,Yang YJ,Huang RH,et al.Myostatin activates the ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome systems contributing to muscle wasting in chronic kidney disease[J].Oxid Med Cell Longev,2015,2015:684965.