猪瘟标记疫苗研究进展

易 琳 黎 鑫 陈金顶 邹创智 范双旗 马圣明 张媛媛 赵明秋

（华南农业大学兽医学院/微生物学与免疫学实验室，广东广州 510642）

猪瘟（classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起的对养猪业构成重大损失的传染病，具有高致病性、高传染性的特点，已被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病，并需及时报告[1]。2017年，国家不再将CSF列入强制免疫计划，对符合条件的养殖场实行“先打后补”的财政补助政策，这表明我国CSF防控取得阶段性成果，CSF防控开始了新的历史阶段。但CSF防控仍面临着若干新问题，该病仍以不同临床表现形式在猪场发生，阻碍着养猪业的健康发展[2]。

CSFV属于瘟病毒属黄病毒科成员[3,4]，为单股正链RNA病毒，基因组5＇端为不加帽的非编码区（UTR），3＇端非编码区（UTR）无polyA尾[5]。仅有一个大的开放阅读框（ORF）编码含3 898个氨基酸的多聚蛋白，形成2个前体蛋白和12个成熟病毒蛋白（C、Erns、E1、 E2、 Npro、 P7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B）[6]，其中E2是病毒诱导机体产生中和抗体的最主要的保护性抗原，也是CSFV毒力的决定因子之一[7]。在感染过程中，Erns能产生中和抗体，诱导免疫反应，防御CSFV强毒的攻击。

1 猪瘟疫苗研究的历史回顾

20世纪早期，由猪高免血清和CSFV制成的CSF疫苗被研发出来。随后，在1936年猪瘟结晶紫灭活疫苗问世，但是由于低效、不安全，升级的猪瘟弱毒活疫苗继而被研发。高效、安全的弱毒活疫苗为此后数十年全球范围内的CSF防控做出了巨大的贡献[8]。其中C株被普遍认为是最好的弱毒疫苗，几乎可作为“金标准”，诱导产生高滴度中和抗体，对CSF各种强毒具有保护力，且免疫力持久。但是其缺点是缺乏合适的血清学标志物概念，无法分别感染和免疫动物[9]。区别于一般弱毒活疫苗，标记疫苗具备安全、稳定和高效等优点，同时在免疫动物后能诱导区分野毒感染的抗体。另外，新型猪瘟标记疫苗可避免在实施猪瘟“扑灭计划（stamping out policy）”时因错杀导致的经济损失，还能及早发现感染动物，以便及时采取控制疫情的措施。因此，为了完善我国猪瘟的防控工作，研发新型的猪瘟标记疫苗刻不容缓。

2 猪瘟标记疫苗

20世纪90年代开始，世界各国的研究人员就新型CSF标记疫苗进行了一系列的探索和研究，诸如亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等，并取得了一定的进展[10]。

2.1 猪瘟亚单位疫苗

亚单位疫苗（subunit vaccine），是指剔除病原体中与保护性免疫无关的、有害的成分，筛选出有效免疫原成分而制成的疫苗。猪瘟亚单位疫苗主要是E2蛋白的亚单位标记疫苗。利用E2蛋白开发的亚单位疫苗在抵抗CSFV野毒株的同时，通过抗Erns蛋白的抗体检测，能够区分出免疫的和感染的猪。1999年，欧盟开始大规模研发E2蛋白亚单位疫苗，并成功诱导免疫猪产生抗CSFV的免疫保护[11]。近年来，越来越多的研究人员在多种表达系统的基础上，对猪瘟E2亚单位疫苗进行了更深层次的研究，如利用腺病毒表达外膜结构蛋白E2与IFNα的亚单位疫苗[12]，毕赤酵母表达[13]、转基因哺乳动物细胞稳定表达[14]、杆状病毒表达[15]和基因工程乳杆菌表达[16]的E2亚单位疫苗。其中，Suárez等[17,18]使用基于慢病毒的基因递送系统来获得稳定的重组HEK 293细胞系，用于表达与猪CD154融合的E2-CSFV抗原。随后，将E2-CD154新型猪瘟亚单位疫苗用于免疫接种试验，相关试验结果显示，该疫苗接种试验猪14天后能够完全抵抗CSFV强毒株攻击，且能对CSFV的垂直传播起到很好的预防效果。在安全性和DIVA特性上，E2-CD154亚单位疫苗初步展现了良好的应用前景。综上所述，猪瘟E2亚单位疫苗具备良好的保护力，是将来防控猪瘟的重要疫苗。

2.2 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗把对宿主无害的活病毒作为载体，构建出能够稳定表达保护性抗原的重组病毒的疫苗。在猪瘟重组活载体疫苗研究中，主要使用的载体病毒有牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）、痘苗病毒（vaccinia virus,VV）、伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）和猪腺病毒（porcine adenovirus,PAV）。

2.2.1牛病毒性腹泻病毒载体疫苗

黄病毒科瘟病毒属成员在核苷酸序列、抗原结构和血清学反应上关系密切，可通过将对应的基因互换构建重组活载体疫苗，其生物学特性和血清学反应与亲本病毒不同，可作为一种标记疫苗。2014年，CP7_E2alf（SuvaxynCSF Marker,Zoetis）被授权为首例针对猪瘟的活标记疫苗，获得了欧洲药品管理局（EMA）的注册许可，并被投入市场应用。Meyers等[19]构建了感染性cDNA克隆BVDV弱毒株“CP7”，Reimann等[20]运用反向遗传等技术，构建了嵌合病毒CP7-E2alf，即以CP7株为骨架，用CSFV“Alfort/187”替换了相应的E2基因。随之对该嵌合病毒进行安全性、效能、免疫原性及标记等一系列研究表明，CP7_E2alf疫苗同传统的猪瘟减毒活疫苗一样安全有效[21]，对于不同基因型的CSFV毒株感染都具保护效力[22]。接种CSFV强毒株“Eystrup”1周内即可获得全面的临床保护，且免疫力至少持续6个月。但是口服疫苗会影响免疫效力[23]。怀孕的母猪及其胎儿通过注射单剂量的CP7_E2alf疫苗得到充分保护，完全防止了中等毒力CSFV的垂直传播[24]，然而，接种CP7_E2alf疫苗的动物与BVDV和BDV毒株存在交叉反应，因此特异性受到影响，并且多重接种和受限的样本都会降低特异性[25]。因此，解决该疫苗在实际中的应用还需新的方法和检测系统[26]。

2.2.2 痘病毒载体疫苗

痘病毒（poxvirus）的基因组有大量的非必需区域，可通过将外源基因插入到这些区域同时表达多个目的基因，且各基因表达互不干扰，遗传稳定，不影响病毒复制。20世纪90年代起，国内外先后利用痘病毒构建猪瘟病毒载体疫苗。Voigt等[27]先抑制性处理了猪外周血中的淋巴细胞，随后用重组口疮病毒ORFV VrV-E2对猪进行免疫攻毒试验，免疫猪血液中未检测到CSFV存在，同时也无临床症状。李谱华等[28]成功构建了含有猪瘟E2基因的重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E2，对试验猪进行疫苗免疫，然后用CSFV强毒石门株以100 LD接毒量攻击，保护率为75%，为后续猪瘟标记疫苗的研发提供了参考。

2.2.3 伪狂犬病病毒载体疫苗

猪伪狂犬病病毒（PRV）具有大量可供外源基因插入的位点，在病毒启动子和特定反式调节因子的共同作用下，插入的外源基因能够成功表达。现有的PRV基因缺失疫苗安全性高并已在世界范围内得到广泛应用。Peeters等[29]构建了gD/gE双缺失的重组病毒并可稳定表达CSFV E2蛋白，随后制备疫苗进行免疫攻毒试验。结果表明，免疫攻毒猪后能同时产生针对PRV和CSFV的保护抗体，存活率为100%。韩爽等[30]以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株，使用同源重组技术构建了表达CSFV C株E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。重组病毒rPRV-CSFV PE2SC较野毒PRV（SX株）、亲本毒rPRV-BE前期增殖效率高，病毒滴度到达峰值时间短，而峰值病毒滴度低于野毒，与亲本毒差异不大。结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，为进一步研发PRV基因缺失重组疫苗提供参考。

2.2.4 腺病毒载体疫苗

腺病毒载体具备多个优点，例如宿主范围广、感染细胞类型多、可高滴度制备、外源基因克隆量大，被广泛应用于重组疫苗的研究当中。孙元等[32,33]通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。然后用rAdV-E2免疫兔和猪，兔只未出现定型热反应，猪只则完全抵抗CSFV强毒石门株。李河林[34]构建了共表达CSFV E2基因和耶尔森菌侵袭素基因C端（InvC）的重组腺病毒载体疫苗rAdV-E2-InvC，并对动物进行免疫攻毒试验，表明其能诱导产生CSF特异性抗体并发挥免疫作用。在此基础上，用FMDV 2A蛋白连接多个基因，进一步构建了rAdV-Erns-2A-E2-2A-InvC、rAdV-Erns-2A-E2-2A-IL2和 rAdV-Erns-2A-E2-2A-NS3 3个重组疫苗。家兔免疫攻毒试验结果表明，这3种疫苗均有免疫保护作用。这些研究成果为新型猪瘟标记疫苗的研发奠定了基础。

2.3 DNA标记疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA（有时也可是RNA）通过一定途径转入动物体内，其被宿主细胞摄取后并表达出抗原，从而诱导特异性的免疫反应，起到免疫保护作用。迄今为止，所有的猪瘟候选DNA标记疫苗都是在猪瘟病毒主要保护性抗原E2蛋白的基础上，诱导免疫应答的重组质粒构建体，基于Erns或NS3蛋白特异性抗体的检测作为DIVA标记原则。余兴龙等[35]构建了E2基因的4种真核表达质粒。其中用有信号肽序列的pcDSW对小鼠进行免疫试验，结果显示，可诱导小鼠产生抗CSFV的抗体，所免疫的猪在强毒的攻击下保护率达100%。然而，临床上使用猪瘟DNA疫苗时存在2个问题：①免疫剂量大，免疫次数多，有时激发的免疫反应弱，无法获得理想的免疫效果；②导入细胞和机体的效率差，抗原表达水平低[36]。为了提高猪瘟DNA疫苗的免疫效果，可用细胞因子作为佐剂共表达E2基因。Li等[37]融合表达四跨膜蛋白分子CD81后发现，其能够提高中和抗体滴度和保护力，加强E2 DNA疫苗的免疫效力。总而言之，DNA标记疫苗显示出良好的应用前景。

2.4 反式互补缺失突变体 （复制子）疫苗

猪瘟的反式互补缺失突变体（复制子）疫苗通常是CSFV的Erns或E2的反式互补缺失突变体。因结构基因被外源基因所代替，故该类疫苗生物安全性高。在这类猪瘟复制子候选疫苗中，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研发的腺病毒甲病毒复制子嵌合载体疫苗rAdV-SFV-E2最具潜力。对此疫苗进行最早提供完全攻毒保护时间的研究，结果显示，rAdV-SFV-E2免疫后3周和4周，能够完全抵抗致死性CSFV强毒的攻击[38]。且免疫效力未受其母源抗体的显著干扰，免疫30日龄的仔猪后能够完全抵抗致死性CSFV强毒石门株的攻击[39]。另外，皮下免疫途径对于该猪瘟疫苗更为有效[40]。最后同时接种伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株和嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2，监测免疫效果表明，同时免疫rAdV-SFV-E2和伪狂犬病疫苗Bartha-K61对rAdV-SFV-E2的免疫效果无干扰现象[41]。

2.5 基因缺失/突变疫苗

基因缺失疫苗是指利用分子生物学技术，寻找与病毒复制无关但与病毒毒力相关的基因，然后将毒力基因部分或全部敲除，且保留其免疫原性的基因工程疫苗。而CSFV感染宿主诱导产生的抗体主要与Erns以及E2发生反应[42]。Widjojoatmodjo等[43]通过基因缺失CSFV Erns构建了突变毒株FL22株（缺66个氨基酸）和FL23株（缺215个氨基酸），随后对试验猪进行免疫攻毒试验，均能诱导产生抗体，有较好的保护作用，同时针对CSFV Erns蛋白抗体建立了DIVA诊断方法。Holinka等[44,45]在El蛋白序列中插入“Flag”标记性抗原表位的同时，对E2基因中单克隆抗体WH303的结合表位进行突变，产生阴性标记，拯救出重组病毒FlagT4v。接种试验猪后，可产生对抗强毒株的保护力。试验猪产生的抗体可特异性结合Flag表位，而不与WH303表位合成的多肽结合，达到了鉴别的目的。随后，突变了FlagT4的E1和E2易突变区域的密码子，构建了猪瘟弱毒疫苗FlagT4Gv，对试验猪进行攻毒后，结果表明具有良好免疫保护效果且遗传特性稳定，但与该疫苗配套的DIVA检测方法还在进一步研究当中。综上所述，基因缺失/突变疫苗因具有几乎所有的CSFV抗原表位，但又大大降低了毒力，为有目的性地构建弱毒疫苗奠定了基础。

3 展望

疫苗免疫是现今防控猪瘟最有效的办法。安全、高效的猪瘟弱毒活疫苗为数十年间猪瘟的有效防控作出了不可磨灭的贡献，但传统的猪瘟兔化弱毒疫苗由于缺乏标记策略，在猪瘟净化中受到了较大限制。猪瘟流行情况的复杂性及临床疾病的非典型性使该疾病的预防愈加困难，因此，研发新型的猪瘟标记疫苗并不断地加以改进日益受到关注。目前大多数新型猪瘟标记疫苗的研究仍处于试验阶段。综合本文的概述可发现，各种候选疫苗仍存在许多缺点，不够完善。对新型猪瘟标记疫苗设计策略研究的同时，需要注意的是对已有候选猪瘟标记疫苗优化问题的解决，使其真正地商品化，为养猪业有效防控猪瘟提供新的途径，更好地实现对猪瘟的控制和净化。