转基因动物制备方法

华再东 任红艳 郑新民

（1动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430064）

转基因技术是分子生物学技术的拓展，是现代探索生命科学奥秘的有效工具，是推动人类社会进步的伟大技术。就目前形势来看，转基因技术已经渗透到我们生活的各个方面，如疾病治疗、疫苗生产、制药、环境卫生、农作物、食品加工等多个领域，具有很好的经济价值和社会意义。

就制备历程来看，动物转基因技术发展主要经历了采用显微注射法及病毒载体法制备转基因动物和基于体细胞克隆为核心技术制备转基因家畜。关于动物的转基因方法，最早是利用胚胎感染反转录病毒进行基因的转移，获得了世界首例转基因动物。之后通过显微操作将外源基因注射到小鼠胚胎，获得了转基因小鼠。1982年，Palmiter等[1]将含有大鼠生长激素的结构基因与小鼠的金属硫-Ⅰ基因启动子相连，再利用显微注射技术将融合后的DNA片段注射到小鼠卵的原核中，最后成功制备了著名的“超级小鼠”，加速了动物生长方式的研究，为人类研究遗传疾病和巨人症建立了动物模型。在此之后，各国科学家和学者掀开了对转基因动物研究的序幕，先后在猪、牛、羊等动物身上取得成功。在1997年，Wilmut等[2]通过体细胞核移植获得克隆羊，动物转基因技术又进入了新的篇章，为动物生物反应器的发展开拓了新的方向。2017年，世界上首例体细胞克隆猴“中中”诞生[3]。

在制备转基因动物的过程中，外源基因很容易发生随机打靶，使得目的基因不表达或低表达，插入正常基因位点影响正常基因表达等，这些因素很大程度上制约了转基因动物的应用发展。为了提高基因编辑的效率，近年来不断发展出新的基因编辑技术，如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等技术。以下综述动物转基因应用的显微注射、逆转录病毒感染、体细胞核移植、胚胎干细胞介导和精子介导等方法。

图1 显微注射制备转基因小鼠示意图

1 显微注射技术

显微注射技术是指在高倍倒置显微镜下，用显微注射针将外源基因导入胚胎或细胞内的一种方法。随着受精卵的不断发育，外源基因被整合到受体基因组中，最后发育成熟为转基因动物。Gordon等[4]首先采用受精卵原核注射方法，将疱疹病毒基因注射到小鼠原核期胚胎的原核内，获得了相应的转基因小鼠（图1）。此技术的优点是实验周期较短，且导入的外源DNA大小不受限制。但其实验要求使用精密仪器且价格昂贵、导入的外源基因拷贝数不受控制等诸多因素也限制了这一技术的使用。尽管如此，考虑到直接作用于基因功能，整合效率较为稳定，所以这项技术目前仍是建立转基因动物的常用方法。

2 逆转录病毒感染法

逆转录病毒感染法（retrovirus-mediated gene transfer）是利用逆转录病毒的侵染能力，将外源基因整合到宿主基因组中，经重组后制备出转基因动物。逆转录病毒(retrovirus)又名反转录病毒，是一组RNA病毒，由于它们在复制过程中必须经过由RNA到DNA这一逆转录的过程而得名。其种类有很多，如人类免疫缺陷病毒 （HIV）、rous肉瘤病毒（RSV）、禽白血病病毒（ALV）等。1974年，Janenisch等[5]利用逆转录病毒介导法将SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔中，经手术转移至子宫内发育，获得转SV40基因的小鼠，为肿瘤病毒垂直传播和表达实验提供了新的研究工具。Bosselman等[6]运用REV病毒作为载体，然后将GH基因导入牛胚胎中，成功制备了转基因牛。逆转录病毒介导法已广泛运用于转基因动物的制备，包括人类遗传疾病的研究、细胞功能缺失校正、遗传物质表达和产物等研究领域。目前，研究结果表明逆转录病毒介导法具有感染效率高、宿主范围广等特点。但是慢病毒载体只能携带小于10 kb的基因片段，存在致癌的风险，且容易出现嵌合体，因此在实际应用中有一定局限性。

3 体细胞核移植法

体细胞核移植技术先将外源目的基因转染到体细胞中，使体细胞在体外培养、传代，筛选出整合有外源目的基因的体细胞作为核移植的供体细胞，然后供体细胞注射到去核卵母细胞间隙，再通过人工激活、融合技术，获得体外重组胚胎，移植给代孕母畜动物体内，获得转基因动物（图2）。在理论上，出生的个体100%是阳性动物，而且外源基因的表达稳定，可显著提高生产转基因动物的效率，降低成本。

2000年，McCreath等[7]应用体细胞克隆生产出世界首例转基因克隆猪，随后2001年又得到双基因敲除的的克隆绵羊。近年来发展起来的用于基因打靶的核酸酶包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）和聚类的规则间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）系统大大丰富了制备用于核移植的体细胞的手段[8-10]。

图2转基因猪制备示意图

4 胚胎干细胞介导法

此法是在体外将外源基因导入胚胎干细胞，然后利用显微操作仪将其注入动物囊胚中，参与宿主胚胎发育，最后得到转基因动物。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）是将早期胚胎的内细胞团分离出来，进行体外传代培养，建立的稳定多能细胞系。这些胚胎干细胞通过脂质体转染、电穿孔或病毒感染等方法将外源基因导入，使ES细胞整合外源基因。利用这些细胞作为核移植的供体细胞，最后通过体细胞克隆技术制备出转基因动物。对已经分化的体细胞进行重编程，以形成类似胚胎干细胞的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells），大大简化了制备转基因动物的过程。有学者分别利用iPS细胞，通过四倍体囊胚注射得到了存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了iPS细胞的全能性[11]。

胚胎干细胞介导法优势在于胚胎干细胞在植入胚胎之前可体外选择特殊的基因型，在细胞水平连续传代、转染，有利于阳性细胞的筛选。但是到目前为止只有小鼠和人的稳定胚胎干细胞系，在其他大动物上，如猪、牛、马等物种，还很难获得稳定的胚胎干细胞系，因此制约了该方法在实践中的应用。

5 精子介导法

精子介导法（sperm mediated gene transfer）是利用精子头部能够捕获外源基因的特性，把精子与外源基因共孵育，使外源DNA被精子捕获，然后再形成受精卵，最后制备出转基因动物。1989年Lavitrano等[12]首次报道把PSV2CAT质粒与小鼠的附睾精子共孵育，得到了阳性克隆小鼠，证明了使用精子作为外源基因的载体制备转基因动物是可行的，这一研究成果得到了广泛的关注。Perry等[13]将外源基因和精子头部混合注入卵母细胞中，获得的受精卵体外培养，进行胚胎移植，成功获得了转基因小鼠。虽然这种方法提高了转基因动物的生产效率，但是该方法对卵细胞的伤害较大，还未被应用于生产实践。目前，很多实验室利用精子载体法获得了很多不同种类的转基因动物，如转基因猴、马、猪等。与其他转基因方法相比，该方法操作简单，使用成本低廉，不需要繁琐的方法步骤和精密的仪器，进而引起了众多科研工作者的重视。该方法缺点是在大动物上获得转基因个体的阳性率较低，不稳定。

综上所述，转基因技术经历几十年的发展，日渐成熟，从随机插入到定点整合，从单一技术到多元手段，科技人员一方面希望通过基因编辑改良动物的遗传性状，充分发挥动物的繁殖率、抗病率，以及改善肉类品质等；另一方面也在研究把动物作为生物反应器去获取人类所需的药品、优质蛋白和动物模型等，并取得了可喜的研究成果。但是在转基因技术的研究中还有很多问题，包括生产技术上的难题和生物安全、人类健康、道德伦理等，这些都是现代和未来的科研工作者亟待解决的难题。转基因技术的应用正在蓬勃发展，目前已经涉及多个领域，未来更有巨大的经济价值和社会意义。