一例猪圆环病毒2型与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

2018-12-17马梓承焦秋林刘照虎王宏宇孟凡亮刘思当

中国猪业 2018年11期

马梓承李焱曹龙焦秋林刘照虎王宏宇孟凡亮刘思当,2,3*

（1山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东泰安 271018；3山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，山东泰安 271018）

目前猪圆环病毒共有3个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV2为猪群主要致病性病毒，也是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和皮炎与肾病综合征（PNDS）的主要病原。主要引起猪只皮肤苍白，被毛蓬乱，呼吸困难，体表浅淋巴结特别是腹股沟浅淋巴结肿大，猪群渐进性消瘦或生长迟缓。且所引起的免疫抑制更是困扰猪场的一大亟待解决的难题[1-3]。

副猪嗜血杆菌病目前是严重危害中国乃至世界养猪业的重要细菌病之一。最近几年，由于中国人口众多，对猪肉食品的高度需要，加上养殖户为了谋求更大的利益，导致保育圈舍的饲养密度越来越大，猪群越来越不安全，副猪嗜血杆菌感染在保育仔猪阶段呈现高发态势[4]。当猪群感染病毒性疾病后，机体抵抗力下降，此时包括副猪嗜血杆菌在内的细菌病便会“乘虚而入”，使得机体在患病毒病的同时继发感染细菌病，加重了动物病情，引起动物最终死亡。据临床病料信息统计，蓝耳病病毒和圆环病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的比例最高。但是随着猪只日龄的逐渐增长，抗生素对于副猪嗜血杆菌的疗效越来越弱，所以早期针对病毒性疾病的完善的免疫流程和合理的药物防治显得尤为重要[5]。为研究和探寻副猪嗜血杆菌病的正确防治流程，现介绍1例山东泰安地区某规模化猪场副猪嗜血杆菌病典型病例的诊断与防治。

1 材料与方法

1.1 发病背景

山东泰安某猪场现有存栏母猪50头、保育猪280头。2018年6月该猪场40余头50日龄左右的保育猪出现高热（39.5～41.5℃），精神沉郁，部分病猪体表被毛粗乱；采食量显著下降，伴有明显的呼吸困难综合征。对病猪注射青霉素，使用包被的恩诺沙星拌料，但效果不理想；发病猪死亡周期较长，一般在7～10 d；随着疫情逐步扩大，1周后保育舍发病率高达60%，死亡率达40%，遂前来就诊。该猪场免疫程序为：仔猪2日龄滴鼻伪狂犬病疫苗，20日龄免疫猪蓝耳病疫苗，28日龄免疫猪瘟疫苗。另了解猪群日常保健不良，病猪曾用恩诺沙星，然而死亡率并未下降。

1.2 主要仪器及试剂

TaqDNA聚合酶，DNA Marker DL 2 000，购自大连宝生物工程有限公司；TSA培养基，TSB培养基，购自美国BD公司；DNA/RNA Kit，Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 送诊病猪临床症状

病猪精神萎靡，不愿走动；呼吸急促，频率快，伴有间歇性咳嗽症状；腹股沟淋巴结肿大异常；高热，体温在41℃左右；呼吸困难，黏膜发绀，体态虚弱。

1.4 剖检变化和样品采集

对送检病猪采取颈动脉放血致死，剖检发现病死猪胸腔、腹腔、肺脏、心脏、肝脏、脾脏等器官表面有大量纤维素性渗出物，并造成不同程度的黏连；心包积液、心脏外侧充满纤维素性渗出物；肺脏间叶、心叶严重实变，手触如橡皮一般，内部气体充盈，切面湿润，有浆液渗出，呈典型“橡皮肺”；全身淋巴结肿大，腹股沟淋巴结肿大，最为突出；肝脏质硬易碎，色泽暗淡，无血色，布满白斑；脾脏表面布满丘陵状出血疹；双肾均见明显的白色斑点状坏死灶（图1）。

1.5 病料处理

各取少量冻存的脾脏、淋巴结、肾脏、肝脏等组织，放入研磨器中，加入1 mL灭菌PBS，将研磨后产物转至1.5 mL灭菌离心管中。在－80℃冰箱中反复冻溶3次后，12 000 r/min离心7 min，将上清吸入1.5 mL灭菌离心管中，备用。使用北京全式金EasyPure ViralDNA/RNA kit（批号：L41228）提取病毒核酸，整个操作流程严格按照试剂盒说明书进行。

图1 病猪脾脏、腹腔、胸腔、肺脏、肝脏、肾脏等器官病变图

1.6 引物设计

根据NCBI上已发表的猪瘟病毒（CSFV）、蓝耳病病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、PCV2经典毒株的保守基因序列设计特异性引物（表1）。

表1PCR/RT-PCRR引物序列

2 结果

2.1 病毒RT-PCR检测结果

通过PCR/RT-PCR方法扩增后，将扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，根据紫外凝胶成像仪下具体条带位置判定病猪的病原感染状况（图2），可知病猪仅感染PCV2，未检出其他病毒。

图2 琼脂糖凝胶电泳图

2.2 细菌分离鉴定

取新鲜肺脏，划线接种于含有10%新生犊牛血清和20 g/mL NAD的TSA培养基上，于37℃培养24～48 h后挑取疑似菌落进行传代纯化，纯化培养后24～48 h可见针尖大小的无色透明且光滑湿润的菌落。革兰氏染色后显微镜镜检可见，呈革兰氏阴性杆菌，具有多种形态，从短杆状、细长杆状到长丝状不等，其中大多数细菌呈略微弯曲的杆状（图3）。

图3 革兰氏染色镜检

2.3 生化鉴定

将分离纯化得到的疑似菌落分别接种于木糖、触酶、氧化酶、吲哚、硝酸盐、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、脲酶微量生化鉴定管中，每支生化管中加入1 μL犊牛血清和1 μL NAD的（V因子），于37℃恒温培养箱中培养24～48 h。其中甘露醇、木糖、脲酶、氧化酶、H2S、吲哚反应呈阴性，蔗糖、葡萄糖、果糖、触酶、半乳糖、硝酸盐反应呈阳性（表2），符合副猪嗜血杆菌生化特性。

表2 生化特性培养结果

2.4 细菌PCR鉴定结果

取提纯后细菌菌液进行PCR检测，经PCR方法扩增后，将扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，可见在821 bp的位置出现了与副猪嗜血杆菌阳性对照相同的条带（图 4）。

图4 琼脂糖凝胶电泳图（副猪嗜血杆菌）

2.5 病理组织学诊断

病理组织学变化见图5，脾脏可见炎性细胞浸润，细胞坏死，视野中充满大量红细胞（图5A）；肾脏间质出血，炎性细胞增生，呈间质性肾炎病变（图5B）；腹股沟淋巴结可见炎性细胞浸润，充满大量嗜中性粒细胞，且伴有大量红细胞（图5C）；心外膜纤维化，心肌炎性细胞增生，间质充血出血，呈间质性心肌炎病变（图5D）；肝脏镜下可见巨噬细胞增生，嗜中性粒细胞增生（图5E）；肺脏可见细支气管充满炎性细胞，以嗜中性粒细胞居多，化脓性支气管炎，间质性肺炎；肺泡腔内浆液性渗出，肺泡间质轻微充血、出血（图5F）。

3 讨论与防治

根据临床病例剖检、实验室检测及组织病理学观察结果分析，该场大规模猪群死亡是因感染PCV2导致机体免疫力下降，后继发副猪嗜血杆菌病。确诊后，及时调整猪场的免疫程序，对未发病猪群紧急补免PCV2疫苗。采用氟苯尼考和黄芪多糖拌料防治，对于发病严重猪，单独注射恩诺沙星针剂，连用1周，及时控制了该场的疫情蔓延，减少了经济损失。

研究发现各地分离到的副猪嗜血杆菌的血清型复杂多样，根据Kieletein-Rapp-Gabriedson琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20%以上的分离株不能定型，各型之间交叉保护力弱[6]。当发生副猪嗜血杆菌感染时，应及时到相应实验室进行检测，进行细菌分离及血清分型鉴定，通过流行病学调查的方法及时明确猪场流行的主要血清型，以便选用合适的疫苗进行补免，对病情较重的猪场应结合抗生素进行防治。然而随着抗生素的大量使用，副猪嗜血杆菌对常用抗生素的耐药性越来越高，采用轮转用药、交替用药可以显著降低副猪嗜血杆菌的耐药性。而不同地区的副猪嗜血杆菌对药物敏感性各不相同，因此药敏试验是筛查敏感药物的一项重要举措。

由于PCV2致死率较低，为节省治疗成本，大多数养猪场总是抱着无所谓的态度，选择不免疫PCV2疫苗，将资金着重用于猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病等高致死性病毒病的免疫。这可能造成PCV2在场内疯狂传播。如果单是感染圆环病毒病，成年猪尚可以耐过，但患病期间，整个猪群免疫力急剧下降，非常容易混合或继发感染病毒病及其他细菌病，造成巨大的经济损失；而且PCV2具有免疫抑制性，当机体内存在此病原时，免疫抗体水平有可能根本无法达到理想的保护水平，给猪场带来极大的安全隐患[7]。

图5 组织病理学切片观察

3.1 隔离淘汰病猪

为避免交叉感染，对于发病的猪只应立即隔离，对发病严重的猪应及时淘汰。

3.2 饲养管理

加强饲养管理，降低养殖密度，加强通风，提高猪舍空气质量[8]；及时清理动物粪便，保持圈舍干燥清洁；加强猪场的卫生消毒，对于外来进场人员一定要先进行隔离，在转群空舍时用高锰酸钾等消毒液对猪场进行全面的消毒，加强对料槽和水槽等用具的卫生保洁工作。

3.3 治疗

病程发展前期，可用阿莫西林、强力霉素各100 g混合600 kg饲料；中期可用20%氟苯尼考100 g、磺胺六甲氧嘧啶100 g混合200 kg饲料，连续投喂1周；后期应考虑耐药性因素，避开平时常喂药物，减少细菌抗药性。将500 g电解多维和100 g阿莫西林混合500 kg水，100 g利巴韦林、200 g磺胺六甲氧嘧啶、180 g多西环素混合在饲料中，投喂猪群1周。在即将痊愈的康复期内，合理添加黄芪多糖，提高猪群的免疫力。