多发性骨髓瘤本周氏蛋白检测及其临床意义

黄国贤，颜绵生

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种起源于B细胞的浆细胞异常增生的恶性肿瘤，发病年龄大多在50～60岁之间，40岁以下较少见，男女之比为3：2[1]。而目前随着人口老龄化以及检测技术不断提高，MM的发病率不断增加，尽管不断有新的药物及治疗方法应用于MM的治疗中，但到目前为止MM仍被认为是不可治愈的[2]。

MM是由于单一株浆细胞异常增值，因而产生大量理化性质十分均一的免疫球蛋白，此蛋白称为单克隆蛋白 （monoclonal protein，M蛋白），M蛋白大多无免疫活性，所以又称副蛋白。M蛋白可以是免疫球蛋白的任何一类，也可以是κ或λ轻链中的任何一型。根据M蛋白的成分可将MM分为不同的类型，其中IgG型约占50%，IgA型约占25%，IgM型约占1%，IgE型和IgD型罕见，轻链型约占 20%[3，4]。

本周氏蛋白（Bence-Jones protein，BJP）即是游离免疫球蛋白轻链，分为 κ(Kappa)、λ(Lambda)2个型别。正常个体每天产生约500mg轻链，合成的轻链除了跟重链形成完整的Ig分子外，将近40%的轻链是游离的[5]，因此可以通过游离轻链(free light chain，FLC)的检测方法检测到。但是，常规的血清蛋白电泳技术（serum protein electrophoresis，SPE），甚至免疫固定电泳技术 （immunofixation electrophoresis，IFE）由于检出低限阈值较高，采用上述检测方法一般无法检出正常人血清FLC[6]。由于B细胞发育过程中κ轻链基因重排具有优先性，所以正常人体内携带κ轻链免疫球蛋白的成熟B细胞多于携带λ轻链免疫球蛋白的成熟B细胞，此外，游离λ链较κ链更易通过二硫键形成二聚体，而后者则通常保持单体状态，且κ滤过速率比λ二聚体快将近3倍。虽然κ型轻链总量约为λ型轻链的2倍，但是最终导致血清中游离型κ/λ的比例低于 2[7]。

目前辅助MM诊断的检测技术有热沉淀法、血清蛋白电泳 （serum protein electrophoresis，SPE）技术和免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）技术。SPE的基本原理是蛋白质在给定的pH条件下主要根据其所带电荷数不同将其分离，形成 5 个不同迁移率区带（Alb、α1、α2、β、γ），具有一定的敏感性和特异性，因此成为临床上初步筛查M蛋白的首选技术。然而，SPE是一种半定量技术，其最低检测M蛋白的浓度是0.13g/L，当M蛋白不出现r区时，易被其它蛋白掩盖。IFE的基本原理是血清区带电泳与免疫沉淀反应结合的一项定性实验，血清先行区带电泳后，分别在电泳条带加上不同类型的抗体，相应的抗原将与抗体在某一区带形成抗原抗体复合物，经漂洗和染色可清晰地显示出抗原抗体反应带。与SPE相比，IFE的敏感性和特异性明显提高，其M蛋白的最低检测浓度为100～150mg/L[8]，而且可对M蛋白进行进一步的分型，特别是在SPE电泳结果似是而非时，该技术有着明显的优越性。因此，至今IFE在鉴定M蛋白方面仍属首选的技术，尤其在鉴定含重链或重链片断的M蛋白时尚无其他技术可以替代。然而，非分泌型MM、游离轻链型MM、淀粉性样变疾病及经过治疗后的MM，由于其产生少量的M蛋白，SPE和IFE难以检测出来。而且，SPE和IFE在临床使用繁琐，尤其是IFE，不仅耗时、费力，且对设备和人员的要求较高，并且这两种方法均不是定量的方法，因此在监测病情方面无法进行量化。

近年来开发出针对轻链“隐藏区”表位(轻链通过二硫键与重链结合的恒定区表位)的检测试剂，该试剂作为抗体只与FLC结合，而不与完整的Ig上的轻链结合，因此敏感性高，特异性强，能检测正常人 FLC 水平，敏感度达到 2～4mg/L[8，9]。 与常用的M蛋白检测方法相比，此方法检测sFLC除高度敏感性和特异性外，还具有检测快速、方便、易于自动化等优点，是一种定量的检测方法，其对MM的早期诊断、鉴别诊断、疗效评估和病情监测等具有不可替代的优势。但是其检测阈值较低，无法区分游离轻链是否为单克隆，在协助MM诊断上存在一定的假阳性和假阴性，而且其试剂价格昂贵，因此尚未于临床诊断广泛开展[10]。

本研究是收集尿本周氏蛋白电泳阳性的MM患者血清和尿液标本，然后采用散射免疫比浊法检测MM患者的血清和尿液总轻链 (游离κ+结合的κ或游离的λ＋结合的λ)并计算κ/λ的比值，还结合免疫球蛋白定量（IgG、IgA、IgM）、血清蛋白电泳、血清及尿液本周氏蛋白电泳的检测，探讨本周氏蛋白（游离免疫球蛋白轻链）检测在MM诊断中的临床意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选取 33例标本均选自2013年 3月－20016年10月在我院住院尿本周氏蛋白电泳阳性的 MM 患者，年龄 36～79 岁，平均年龄 56±11.4 岁，其中男性17例，女性16例，所有患者均符合文献MM诊断标准[11]。

对照标本分为两组，第一组为19例尿蛋白异常(尿白蛋白＞30mg/L)的非MM病人尿标本，其中肾病综合征女性患者3例、男性患者4例，糖尿病肾病女性患者患者2例、男性患者3例，急性淋巴瘤女性患者2例、男性患者2例，SLE女性患者3例，年龄 29～78 岁，平均年龄 50.6±13.1 岁；38 例尿蛋白正常的非MM病人尿标本，女性15例，男性23 例，年龄 14～71 岁，平均年龄 49.6±13.6 岁。第二组为43例非MM病人的血清对照标本，女性18例，男性 25 例，年龄 15～85 岁，平均年龄 49.2±19.1岁。两组对照标本人群的年龄、性别等相关因素均与 33例 MM 患者相仿，无统计学差异（P＞0.05）。

1.1.2 标本采集 MM患者和对照组病人于清晨空腹留取静脉血6ml，促凝管保存，标本要求无脂血、溶血，3500rm/min离心5min，吸取上层血清分别移至1个1.5ml EP管，－70℃冰箱放置备用，同时期留取患者尿液标本 （晨尿），然后移至1个1.5ml EP管，－70℃冰箱放置备用。

1.1.3 主要仪器及试剂 采用法国 Sebia公司的Hydrasys全自动电泳仪，及其配套试剂包括琼脂糖凝胶，样本稀释液缓冲液，抗IgG、IgA、IgM抗体，抗IgGAM混合抗体，抗 κ、λ抗体、抗游离 κ、游离 λ抗体，酸紫液，试剂批号15048101；美国德灵公司的BN II和BN Prospec全自动特定蛋白分析仪及其配套试剂盒，试剂批号为12258B。

1.2 方法

1.2.1 血清蛋白电泳 取患者血清10μl按要求点于Sebia配套加样梳上，经琼脂凝糖胶电泳后，烘干、染色、再褪色、烘干。然后通过光密度扫描，观察M蛋白成分的含量。

1.2.2 血清免疫固定电泳 取患者血清 （加在抗IgG条带的血清标本进行6倍稀释）10μl按要求点于Sebia配套加样梳上，经琼脂凝糖胶电泳后，在每份标本的6条区带依次加固定液40μl，抗IgG、IgA、IgM，抗 κ、抗 λ 试剂各 25μl，孵育 5min 以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干，完毕后观察结果。

1.2.3 血清和尿液本周氏蛋白电泳 患者血清用(尿液不用稀释)稀释液进行4倍稀释后，取10μl稀释血清按要求点于Sebia配套加样梳上，经琼脂凝糖胶电泳后，在每份标本的6条区带依次加固定液 40μl，抗 IgGAM，抗 κ、抗 λ、抗游离 κ、抗游离λ 试剂各 25μl，孵育 5min（尿液 10min）以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干。完毕后观察结果，如果抗IgGAM阴性，抗κ或抗λ区带阳性，且在同一位置抗游离κ或抗游离λ区带阳性，则判断本周氏蛋白电泳阳性。

1.2.4 血清总轻链（κ、λ）的测定 血清轻链测定应用散射免疫比浊法，其抗体是通过高纯度人免疫球蛋白κ、λ轻链在兔子身上免疫反应而制备的，结合于轻链的非结合区，所测定数值包括了游离轻链值及与重链相结合的轻链数值，为总血清轻链数值。具体要求按BN-II全自动特定蛋白分析仪说明操作。

1.2.5 血清免疫球蛋白定量测定 血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）的测定应用散射免疫比浊法，采用的抗体是通过高纯度人免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在兔子身上免疫反应而制备。具体要求按BN-II全自动特定蛋白分析仪相关要求操作。

1.2.6 尿微量免疫球蛋白定量测定 尿微量免疫球蛋白（κ、λ、IgG、白蛋白）的测定应用散射免疫比浊法，其采用的抗体与血免疫球蛋白测定是一致的。具体要求按BN-Prospec全自动特定蛋白分析仪相关要求操作

1.2.7 统计学分析 所得的数据资料采用SPSS 15.0统计软件进行Mann-Whitney U检验，P<0.01表示有统计学意义

2 结果

2.1 33例MM患者的电泳结果

2.1.1 血清蛋白电泳的结果 血清蛋白电泳见图1，对M蛋白的判断通过二人检验结果确定，阳性率为79%。4例轻链型MM患者（见图1的6、16、23、28区带）、2例 IgA 型 （见图 1的 2、32区带）、1例IgG（见图1的21区带）的电泳区带上看不到明显的M蛋白带。电泳区带1、5、27是IgA-λ型，4、9、25 是 IgA-κ 型；电泳区带 3、7、12、15、17、18、22是 IgG-λ 型 ，8、10、11、13、14、19、24、26、29、30、31、33是 IgG-κ 型。

图1 33例MM患者血清蛋白电泳图谱

2.1.2 免疫固定电泳结果 33例MM患者血清蛋白电泳、血清免疫固定电泳、血清本周氏蛋白电泳、尿本周氏蛋白电泳结果见表1。血清免疫固定电泳对轻链型的MM结果难以判段，只能怀疑可能出现游离的轻链或者应用IgE型和IgD的抗体进一步应用免疫固定电泳确诊，由于该两型罕见，目前成本昂贵。而进行血本周氏蛋白电泳结果阳性率虽然只有30%，但4例轻链型的MM阳性率为100%，由于血清样本相对干扰比尿液小，其配合血清免疫固定电泳可明显有助于对常见MM病人进行确诊。

表1 33例MM患者四种电泳结果数据统计

2.2 尿蛋白定量结果 33例MM患者、19例尿蛋白异常的非MM病人（肾病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的浓度、尿κ/λ的比值结果见表2和图2。与尿蛋白异常的非MM病人及尿蛋白正常的非MM病人相比较，MM病人的偏离明显，P<0.01。与尿蛋白正常的非MM病人相比较，偏离更明显，P<0.01。但是，尿蛋白异常的非MM病人κ/λ的比值与尿蛋白正常的相比较无明显差异，P=0.215，不具统计学意义。

2.3 血清免疫球蛋白定量结果 33例MM患者的血 κ、血 λ 的浓度(见表 3、图 7、8），血 κ/λ 的比值(见图9）与43例非MM患者相比较见，偏离非常明显，P<0.01，具有显著的统计学差异（见表3）。

3 讨论

MM系骨髓中恶性浆细胞过度增殖，导致血清或尿液中出现单克隆性免疫球蛋白或其轻链、重链的一种疾病。正常人血清中，免疫球蛋白分子是由多克隆性质的浆细胞按一定比例合成的，因此血清中Ig及κ、λ轻链保持在一定范围内。在MM发生后，Ig合成受影响，异常增生的肿瘤细胞产生了大量的单克隆Ig及其片断。因此测定血清及尿中的单克隆免疫球蛋白在MM的诊断及疗效评估中具有重要的指导意义。

图2 33例MM患者、19例尿蛋白异常的非MM病人（肾病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的浓度、尿κ/λ的比值结果分布

图3 血清κ轻链、λ轻链及κ/λ比值结果分布

本研究中，尿本周氏蛋白电泳阳性的33例MM患者，其SPE结果显示9%的病例M蛋白呈单株峰，其中4例轻链型MM在γ区看不到M蛋白区带，2例IgA和1例IgG在γ区可见弥散的M蛋白区带，但这7例MM患者的血清免疫固定电泳结果（除1例κ轻链和1例λ轻链外）均可看到浓集、窄细、深染的M带。33例MM患者血本周氏蛋白电泳阳性率仅有30%，远远低于SPE和IFE，但血本周氏蛋白电泳也有它自身的优势，本周氏蛋白电泳每份标本共有 6 条泳道：ELP、GAM、κ、λ、游离κ、游离λ，ELP泳道相当于血清蛋白电泳，在结果判断中起对照作用，GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM 3种免疫球蛋白重链的混合抗血清，该泳道出现克隆带即提示3种免疫球蛋白的其中1种呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗结合型和游离型轻链的混合抗血清，标本中只要有克隆性的轻链(与重链结合或游离于血中)存在，该泳道即出现克隆条带。游离κ和游离λ泳道加入抗游离轻链抗血清，该泳道出现克隆条带则提示标本中有单克隆游离轻链存在。因而4例轻链型MM在游离κ或游离λ泳道上可看到明显M带。在M蛋白筛查方面，由于单克隆免疫球蛋白的类型不同，其分子大小亦不同，因此在电场泳动的速率不同，导致单克隆成份可出现在 γ 区 (IgG、IgM 型)、α1、α2或 β 区（IgA型、轻链型），当单克隆成分不出现在γ区或其他肾病引起α2或β区升高时，SPE则有较大缺陷不能明确单克隆成份的有无，对于这种情况需要IFE进行鉴别，IFE仍然是检测M蛋白的金标准[12-14]。血本周氏蛋白电泳是在免疫固定电泳的基础上利用了抗游离κ和抗游离λ抗体检测血清中的游离轻链，因此，IFE结合血清本周氏蛋白电泳可进一步提高MM分型的阳性率。

表2 33例MM患者分别与19例尿蛋白异常的非MM病人、38例尿蛋白正常的非MM病人相比较（M±SD）

表3 33例MM患者与43例非MM患者血本周氏蛋白相比较（M±SD）

据文献报道， 尿液中 κ/λ 在 0.75～3之间可排除单克隆轻链增多，当 κ/λ＜0.5 或 κ/λ＞5 时可以肯定尿中单克隆轻链增多，因此测定κ与λ的浓度并计算κ/λ的比值在MM的诊断上有重大意义[15-18]。本研究中33例MM患者尿液中κ或λ的浓度远远高于对照组，及κ/λ的比值也远远偏离0.75～3范围。对照组中，尿蛋白异常的非MM病人κ/λ的比值与尿蛋白正常的非MM病人相比较是没有统计学意义的，也就说尿蛋白异常的病人包括肾病病人、结缔组织病病人、淋巴瘤病人等，尿液中κ与λ的浓度会增高，但一般不会超过100mg/L，而且是按一定比例增高的，其比率维持正常。尿本周氏蛋白电泳作为MM的筛查手段，其结果的判断存在许多不确定的因素，在一定程度上影响MM诊断的准确率。然而利用散射免疫比浊法对尿液中的κ和λ定量并计算κ/λ比值，对提高临床MM诊断效率有很大的帮助。

外国有研究表明， 血清 κ/λ 比值采用 0.3～2.0的参考范围可早期发现低产量M蛋白的MM，还可进行疗效判断，预后监测等[9，19]。33例MM患者血清中κ或λ明显升高，κ/λ的比值远远偏离正常对照值，具有显著的统计学差异。血清中κ与λ的量反应的就是肿瘤的负荷关系，因此测定血清中κ与λ的浓度及κ/λ的比值可以很好地评价MM患者的体液免疫状态。