全自动生化分析仪法测定红细胞脆性的性能研究及在地中海贫血筛查中的应用

冯志刚，梁爱芬，雷亚利，华仙丽，隋洪

地中海贫血是人类最常见的单基因遗传病之一，全世界约有1亿以上人口携带地贫基因[1，2]。我国南方尤其海南、贵州、广西、云南、广东、江西等地区为高发区[3-7]。由于地中海贫血基因携带者的临床表型有很高的异质性，因此基因诊断才是地中海贫血确诊的金标准[8-11]。2012年国家卫生计生委启动实施地贫防控试点项目，2012年1月至2015年9月，试点地区共为54.13万对新婚和计划怀孕夫妇免费提供地贫筛查和基因检测。鉴于各地区技术和经济发展的不平衡性，作为地贫的筛查指标，红细胞参数、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳等简便经济的实验室检测项目，仍发挥着其不可或缺的作用[12-18]。市面上在售的红细胞脆性检测试剂盒（自动生化分析仪法）数量不多，且提供的多为通用参数，未指定仪器型号。本文使用武汉市长立生物技术有限责任公司生产的红细胞脆性(EFT)测定试剂盒(直接比色法)结合SIEMENS公司的ADVIA 2400生化分析仪，建立了一种操作简便、准确快速、成本低廉，且可进一步实现自动化分析的地贫筛查方法，研究其方法学参数并验证临床性能，供广大的临床实验室同行和临床医生参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 ⑴SIEMENS公司生产的ADVIA 2400全自动生化分析仪。武汉市长立生物技术有限责任公司生产的红细胞脆性 (EFT)测定试剂盒(直接比色法)，注册证编号鄂械注准20142401475，组成自动生化分析仪检测法，通过检测反应体系中红细胞悬液的浊度变化来计算溶血百分比。⑵上海精密科学仪器有限公司棱光722N可见分光光度计，配套广州市米基医疗器械有限公司生产的红细胞渗透脆性检测试剂盒(一管法)，粤食药监械(准)字2013第2400503号，组成手工法溶血百分比检测法，通过检测反应体系中游离血红蛋白的光密度变化来计算溶血百分比。

1.2 自动生化分析仪检测法参数优化

1.2.1 波长的选择 ADVIA2400生化分析仪为光栅后分光，可以提供 340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm等14个波长的数据，根据反应原理，分别用生理盐水和长立试剂中的溶血剂作用于相同量的全血，测定不同波长下的光密度系列值，选择浊度变化明显而血红蛋白光密度背景低的波长作为检测波长。

1.2.2 样本体积分数的确定 为了降低透光率读数误差的影响，固定试剂体积为100μl，样本为40μl全血加入到960μl生理盐水中制备成上机检测红细胞悬液，在方法学参数设置界面依次设定样本量 14μl、7μl、3.5μl，并分别对应增加生化分析仪机内生理盐水样本稀释液体积保证反应总体积一致，进行红细胞脆性平行检测来优化加入反应杯中的稀释样本量。

1.3 方法学性能

1.3.1 重复性 在确定自动生化分析仪检测红细胞脆性试验参数后，选择正常与病理标本各1份，分别重复测定红细胞脆性各10次，计算均值、标准差和变异系数，评估批内精密度，与试剂说明书中厂商声明标准比较。

1.3.2 方法学比对 收集2016年4月我院门诊、住院患者静脉血标本共计99例，其中病例组14例（经深圳益生堂生物企业有限公司地中海贫血基因检测试剂盒检测基因型确诊）， 年龄 27.2±8.3岁；对照组 85 例，年龄 25.8±10.4 岁。

使用广州阳普医疗科技股份有限公司生产的EDTA·K2管抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml，收到标本后保存在2～8℃冰箱，分别使用武汉长立和广州米基方法24h内检测。计算出溶血百分比数值分别与两者试剂说明书参考区间比较，判断脆性试验阴阳性，并以基因型为准的临床诊断为金标准。

1.3.3 统计学分析 使用SPSS 19.0软件进行统计学处理和分析，定量资料的比较使用t检验，定性资料的比较使用卡方检验，一致性检验使用Kappa检验。

2 结果

2.1 波长的选择 从ADVIA 2400全自动生化分析仪获得原始光密度数据，比较不同波长处红细胞悬液、游离血红蛋白溶液光密度。340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm 处红细胞悬液 的 光 密 度 依 次 为 1.26734，1.73038，1.249 15，1.12029，1.08021，1.19975，1.02064，0.97956，0.97159，0.95745，0.95100，0.94740，0.94309，0.9421 1；游离血红蛋白溶液的光密度依次为0.87212，2.62122，0.48450，0.24424，0.18837，0.401 93，0.43583，0.05860，0.02476，0.02230，0.02081，0.02067，0.02082，0.02054，将数据制成图 1，可以看出，在596nm波长附近，游离血红蛋白溶液光密度已远远小于红细胞悬液的光密度，因此选择596nm波长作为检测波长。

2.2 样本体积分数的确定 为了降低透光率读数误差的影响，分光光度法检测技术一般选择透光率 0.2～0.7 的读数范围， 已知 ADVIA 2400 的比色杯光径为0.5cm，表2中显示的读数为标化成1cm光径的读数，所以选择表中透光度0.339797对应的样本量7μl。见表2。

图1 红细胞悬液、游离血红蛋白溶液的光密度和波长关系图

表2 ADVIA 2400生化分析仪样本量与反应体系光密度透光率

2.3 批内精密度结果 评估标准为试剂说明书中厂商声明标准，结论为符合厂商声明标准。见表3。

表3 正常与病理标本溶血百分比精密度与厂商标准比较

2.4 两种方法诊断一致性Kappa检验结果 对长立和米基两种方法的诊断一致性进行Kappa检验，Kappa值为0.54，结论为两者一致性中等。见表4。

表4 两种方法诊断一致性Kappa检验结果

2.5 方法学的性能指标 以临床诊断为金标准，两种方法学的性能指标如表5，可见长立方法的敏感度略高，但特异度低于米基方法。

3 讨论

正常红细胞的形态为双凹圆盘形，试验时置于低渗性氯化钠溶液中，水分子在细胞内外渗透压差的条件下进入红细胞，红细胞发生肿胀甚至破裂而发生不完全或完全溶血，这种红细胞在低渗盐溶液中出现溶血的特性即红细胞渗透脆性。渗透脆性升高可见于遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、阻塞性黄疸等疾病，减低可见于各型珠蛋白生成障碍性贫血、HbC、HbD、HbE血红蛋白病、缺铁性贫血、脾切除术等情况，近年来其临床应用范围不断得到拓展[19]。临床上基于此原理建立和应用的实验方法有红细胞渗透脆性过筛实验、红细胞渗透脆型简易初筛实验，红细胞渗透脆性实验光电比色法，红细胞孵育渗透脆性实验，红细胞渗透脆性检测一管法等，其中以红细胞渗透脆性检测一管法操作较为简单，在我国南方地中海贫血高发区域广泛的应用于该疾病的初筛。随着实验室高度自动化信息化的发展，以上多数方法固有的手工操作，步骤繁琐，效率偏低，结果重复性差的缺点日益凸显。国内有些厂家开发出应用于全自动生化分析仪检测的试剂盒，仅提供少数品牌和型号生化分析仪的方法学参数和性能指标，且对其实验原理阐述不深。本文根据红细胞渗透脆性现象的的基本实验原理，挖掘分析SIEMENSADVIA2400生化分析仪提供的多波长，全反应时间读点的光学检测数据，优化针对该全自动生化分析仪的方法学参数，并对仪器法和手工法的方法学性能比较做了初步的分析比较。

表5 两种结果与临床诊断结果的符合情况

本实验结果表明，全自动生化分析仪法测定红细胞脆性法，高值水平重复性1.6%，低值水平重复性3.4%，符合厂商标准，接近许多临床化学常规项目。长立法敏感度、特异度分别为85.7%、77.6%，米基法分别为78.6%、94.1%，在临床应用于地中海贫血筛查方面长立法具有一定的优势。潘干华[20]所报道的两点比浊法测定红细胞脆性半自动生化仪法筛查地中海贫血的敏感度、特异度分别为86.3%，95.5%，本文全自动生化仪方法在操作上具有较大优势，在灵敏度方面与其相当，在特异度方面与其尚有差距，分析可能为本文研究对象数量相对较少，拟在今后的临床工作中不断积累相关数据进行更深入的研究。综上所述，全自动生化分析仪法在方法学性能和临床性能方面均能满足地中海贫血筛查的需要，宜在广大地中海贫血流行地区大力推广。