应用流式液相芯片技术分析厦门地区女性人乳头瘤病毒感染现状

晁鹏丽，黄松洁，方赞熙

随着生物科学领域研究的不断深入，生物芯片面世，然而由于生物芯片技术本身的局限性，并不能很好地运用于临床。美国Luminex公司研发了液态芯片技术——多功能多指标并行分析系统（Flexible Multi-Analyte Profiling system，xMAP 技术）解决了这个问题，xMAP技术1次检测，最多可以检测100种指标，既能检测蛋白质，也能检测基因。在本研究中，利用该技术对HPV的27个亚型可同时进行分析。

人乳头瘤病毒（HPV）是目前唯一确定的与肿瘤相关的病毒，除了众所周知的宫颈癌，还与喉鳞癌，以及一些生殖器、肛门等癌症相关。其中宫颈癌是女性好发肿瘤之一，居第二位。我国每年新发的病例约有十几万，其中近两万人死于该病，而HPV是宫颈癌发生发展的必要条件。本研究通过对本地区517例体检女性宫颈脱落细胞进行HPV基因的27个常见亚型的检测，探讨HPV隐性感染及亚型分布情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2014年10月至2015年6月在厦门大学附属中山医院体检的517例女性，均无明显临床症状。年龄范围25～73岁，取材时要求避开月经期，48h内无性生活、阴道未使用药物冲洗液。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 先用无菌棉签擦去宫颈口过多的分泌物，然后用配套的采样刷子，按照妇科常规取样程序，采集宫颈脱落细胞。采集手法需轻柔亦要保证采集到足够量的细胞可供检测。采集完毕后将刷子放入专用样本管，轻轻摇晃管子，利用管内的保存液将刷子上的细胞洗脱下来。盖紧瓶盖，做好标记。并在“醋酸白”等实验前，采集宫颈脱落细胞。4℃保存，一周内检测。

1.2.2 仪器与试剂 主要仪器：Life Eco基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），Luminex 200多功能流式点阵仪（上海透景生命科技有限公司）。试剂：人乳头瘤病毒基因分型试剂盒(上海透景生命科技有限公司)。共可检测27种亚型，依据Cogliano V[1]和Schiffman M[2]的报道分为低危亚型10种：6、11、40、42、43、44、55、61、81、83；高危亚型 17 种：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82；以及内对照 Globin。

1.2.3 HPV DNA 提取 充分混匀样本，吸取 200μl到洁净的 1.5ml离心管，14000r/min 离心 3min，吸弃上清，每管中加入200μl的提取缓冲液，振荡均匀，放入100℃金属浴中保温15min，将离心管取出14000r/min离心5min，上清液备用。

1.2.4 PCR扩增 取PCR反应管，在其中加入15μl配制好的反应体系和5μl的已提取待测样本，加样结束后放置扩增仪中进行扩增。

1.2.5 杂交与荧光染色 在杂交板各 孔中加 入22μl微球杂交液，再在对应孔中加入3μl的PCR扩增产物，杂交完成后，加入75μl的荧光素SAPE，反应 15min。

1.2.6 上机检测 将微孔杂交板快速转移至预热好的Luminex流式分析仪上读取结果。结果判断：透景HPV计算软件可以自动判断结果。其判断的标准如下：每孔均含阳性内对照Globin，内对照Globin的信号大于150，且大于等于2.5倍背景信号值，如否，可能是样本中没有采集到细胞或某种试剂失效，则需重新采样重新实验。各亚型阴阳性判断亦遵从该标准，亚型信号＞150，且≥2.5倍背景信号，为阳性；反之，为阴性。

1.3 统计方法 应用SPSS 19.0软件分析数据，感染率的差异比较用χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染情况 517例体检女性中总的HPV感染率为 19.3%，按年龄分为 25～30 岁、31～35 岁、36～40 岁、41～45 岁、46～50 岁、51～55 岁、＞55 岁 7个组， 各组 HPV 感染率分别为 18.9%、25.0%、16.2%、24.0%、18.5%、18.6%、12.3%，χ2=5.446，P=0.488；各组低危感染率分别为 1.9%、13.2%、5.4%、4.2%、4.9%、7.0%、3.7%，P=0.108（精确概率法）；高危 感 染 率 分 别 为 17.0% 、19.7% 、10.8% 、20.8% 、16.0%、11.6%、8.8%，χ2=6.675，P=0.352。 差异均无统计学意义。HPV阳性例数中总的人群混合感染例数占 27.0%， 各年龄组分别为 10.0%、63.0%、27.8%、8.7%、40.0%、0、12.3%，P=0.02 （精确概率法），差异明显，其中以31～35年龄组最高、其次是46～50年龄组、再次是36～40年龄组。结果见表1。

表1 总人群及各年龄段HPV感染率、低危感染率、高危感染率和混合感染率

2.2 不同年龄组亚型分布情况 31～50年龄段低危亚型感染呈多样化，而25～30年龄段和＞50岁年龄段低危亚型感染较单一。高危亚型：25～30年龄组常见感染亚型是18型和52型；31～35年龄组16和52型最多，其次是18和59型；36～40年龄组51、52、53、56 和 59 型较其他型多见；41～45 年龄组 52 型较多见；46～50 年龄组 39、51、52、58 较其他型多见；51～55年龄组亚型分布较简单，仅有51、52和53型，其中以52型最多见；＞55年龄组HPV阳性的7例检出的高危亚型有16、39、52、56和 58。而 26、31、35、82 则未发现感染例数。结果见表2。

3 讨论

1995年，国际癌症研究署确定了“HPV感染是女性宫颈癌和宫颈上皮内高度瘤变（CINⅡ/Ⅲ）发生的必要条件”，历年来的多项研究也进一步证实了此观点[3，4]。但由于在感染的初期，多数因为临床症状不明显或为炎症表现，而被忽视甚至误诊，导致延误治疗时机，而逐渐病情恶化最终恶变。本文针对2014年10月至2015年6月期间来本院体检的健康女性(年龄跨度25～73岁)的HPV检测结果进行统计分析，发现这一人群中HPV的感染率高达19.3%，且与年龄无明显相关性，与项璐璐和姜树朋报道的数据 21.7%和 21.1%相近[5，6]。 女性HPV低危亚型感染通常引起一些妇科良性病变，而高危亚型感染才是导致恶性病变的高风险因素。本文对HPV低危感染率和高危感染率进行统计分析，发现人群总的HPV低危感染率为5.8%，而HPV高危感染率为15.5%，HPV高危感染要高出低危很多，且各年龄组均是如此。从年龄特点来看，HPV低危感染31～35年龄组高于其他年龄组，高危感染各年龄组无明显差异。陈占国[7]报道相较于HPV单一感染，混合感染危害性更大，HPV混合感染是宫颈上皮由低级别病变向高级别病变发展进而演变为宫颈癌的重要危险因素之一[8]，本结果中人群总的混合感染率为27.0%，其中31～35年龄组高达 63.2%， 其次是 46～50 年龄组 40.0%，再次是36～40年龄组27.8%。综合上述结果可知，各年龄段的女性人群均存在宫颈癌发生的高危因素，31～35年龄段因其较高的HPV混合感染率而大大提高了患病的风险性。

表2 不同年龄组亚型分布情况（感染率）

高危型HPV致恶性病变能力与亚型密切相关[9]。2005年2月，经国际癌症研究署研究讨论，导致宫颈癌的13种高危HPV亚型被确定，而当HPV检测应用于宫颈癌筛查时不同亚型的致恶变能力差异需作为关键因素考虑在内。在中国宫颈癌常见的高危亚型有 8 种：16、18、58、52、31、33、59 和45型[10]。在本结果中，不同年龄组HPV亚型分布特点：31～50年龄段低危亚型感染呈多样化，而25～30年龄段和＞50岁年龄段低危亚型感染较单一。HPV高危亚型25～30年龄组感染以18型和52型为主；31～35年龄组16和52型最多，其次是18和59 型；36～40 年龄组 51、52、53、56 和 59 型较其他型多见；41～45年龄组52型较多见；46～50年龄组39、51、52、58 较其他型多见；51～55 年龄组亚型分布较简单，仅有51、52和53型，其中以52型最多见；＞55年龄组HPV阳性的7例检出的高危亚型有 16、39、52、56 和 58。 从本结果分析得出：宫颈癌常见亚型中， 本地区25～30岁、31～35岁和＞55岁这三个年龄段的女性以感染HPV16型和HPV18型为主；36～40、41～45、46～50、51～55 这四个年龄段的女性以感染HPV52型和HPV58型为主。总体来说，本地区常见亚型基本和我国其他地区相符[11-13]。而不同年龄段间亚型分布的差异，可能与以下两点有关：⑴机体防御清除病毒的能力；⑵性生活的频次以及性伴侣的专一性。其中的相关性有待进一步地验证。

从本结果研究分析来看，HPV感染可发生在各个年龄段， 且在 31～35、36～40 和 46～50 岁这三个年龄段中混合感染的几率大。而HPV亚型与致病力及宫颈癌发病风险相关，HPV16和18是感染比例最高且与宫颈癌密切相关的主要2种亚型[14，15]， 在本结果中 25～30、31～35 岁和＞55 岁这三个年龄段的女性HPV16型和HPV18型感染率较大。因此各年龄段的妇女都应重视HPV筛查，在有条件的实验室应尽可能开展HPV亚型检测，可指导医生更早地预警宫颈癌。针对HPV感染人群应结合宫颈脱落细胞检查，定期监测，积极治疗，预防宫颈癌的发生。