电针对帕金森病模型大鼠黑质内Bip、CHOP蛋白表达的影响

马骏,王中明,王述菊,余沛豪,王彬,王琪



电针对帕金森病模型大鼠黑质内Bip、CHOP蛋白表达的影响

马骏,王中明,王述菊,余沛豪,王彬,王琪

(湖北中医药大学,武汉 430065)

观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质内质网应激相关蛋白表达的影响。将120只健康雄性SD大鼠随机分正常组、假手术组、模型组、电针预治疗组、电针治疗7 d组、电针治疗14 d组、电针治疗21 d组、电针治疗28 d组,每组15只,采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD模型,假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液。正常组、假手术组、模型组不做任何治疗;电针治疗组在造模完成后选取风府、太冲穴给予电针治疗;电针预治疗组电针治疗7 d后再造模。运用免疫组化法检测大鼠黑质内TH、a-syn的阳性表达,并用Western blot法检测大鼠中脑黑质区内Bip、CHOP蛋白表达的变化。模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后大鼠行为学评分明显降低(＜0.01);与正常组和假手术组相比,模型组大鼠黑质区a-syn的阳性表达与Bip、CHOP蛋白的表达均显著提高,大鼠黑质区TH的阳性表达均显著降低 (＜0.01);与模型组相比,电针治疗各组大鼠黑质区a-syn的阳性表达以及Bip、CHOP蛋白的表达均显著降低 (＜0.01),大鼠黑质区TH的阳性表达显著提高(＜0.01)。电针防治PD的机制可能与电针能明显抑制内质网应激相关蛋白的表达,保护多巴胺能神经元有关。

针刺疗法;帕金森病;电针;内质网应激;免疫球蛋白重链结合蛋白;CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白;大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease, PD),又称震颤麻痹,是中老年常见的一种以黑质纹状体通路功能减退为主要特征的神经退行性疾病,其主要的临床症状为肌肉僵直、四肢震颤、运动迟缓以及步态不稳。病理表现为黑质致密区多巴胺神经元变性坏死伴胞浆内嗜酸性包涵体--路易小体(1ewy body, LB)的形成路易小体的主要成分是a-突触核蛋白(a-synuclein,a-syn)[1-2]。a-syn异常聚集可引起内质网应激。PD的发病原因尚未完全明了,相关研究表明,氧化应激、线粒体功能障碍、泛素蛋白酶系统损伤、异常蛋白沉积等均与PD发病有关。内质应激是细胞凋亡的重要途径之一,相关研究表明内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在PD发病过程起重要作用[3]。内质网分子伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(binding immunoglobulin heavy chain protein, Bip)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer- binding protein homologous protein, CHOP)是ERS的两个经典标志物,GRP78表达上调可减轻ER蛋白负荷,对细胞起保护作用,而CHOP表达上调则激活细胞死亡,启动细胞凋亡途径[4-5]。本研究通过观察电针对PD模型大鼠Bip及凋亡因子CHOP的影响,探讨电针治疗PD的可能作用机制,旨在为PD发病机制及治疗靶点研究提供一定的理论基础,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验选用SPF级健康雄性SD大鼠120只,体重(180±20)g,由武汉大学实验动物中心提供,许可证号[SCXK(鄂)2014-0004]。所有动物均在通风良好的条件下分笼饲养,自由摄食及饮水。随机分为正常组、假手术组、模型组、电针预治疗组、电针治疗7 d组、电针治疗14 d组、电针治疗21 d组、电针治疗28 d组,每组15只。

1.2 主要试剂及仪器

鱼藤酮、葵花油(购于Sigma公司);兔抗Bip(武汉三鹰生物技术有限公司,11587-1-AP);兔抗CHOP(santa cruz,sc-575);显影定影试剂盒(武汉巴菲尔生物技术有限公司);丙烯酰胺(Amresco公司);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,CPA);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);微量移液器(北京六一仪器厂,DYY-7C);垂直电泳槽(北京六一仪器厂,DYCZ-24DN);电转仪(北京六一仪器厂,DYCZ-40);水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司,TS-1);X光胶片(柯达,XBT-1);0.30 mm×13 mm不锈钢毫针(北京中研太和医疗器械有限公司);G6805电针治疗仪(青岛鑫升实业有限公司)。

1.3 动物模型制备及鉴定

所有大鼠适应环境1星期后,采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD大鼠模型[6-7],模型组和电针治疗组给予鱼藤酮(2 mg/kg,溶解于葵花油,浓度2 mg/mL)颈背部皮下注射,每日1次,连续28 d;正常组不做任何处理;假手术组方法同模型组,但只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液(溶剂);电针预治疗组先对正常大鼠电针治疗7 d,然后造模。

造模后观察大鼠的行为学改变,参照陈忻等[8]的行为学评分标准,对各组大鼠进行评分。评分标准如下,1分为大鼠出现拒捕行为减弱、弓背、竖毛、毛发变黄变脏、主动活动减少;2分为有1分的表现,且主动活动减少更加明显,并伴有震颤、动作迟缓、或有步态不稳;4分为有2分的表现,且步态不稳,或不能直线行走、或行走时向一侧旋转;6分为向单侧斜卧,单侧前肢或后肢瘫痪,行走困难,进食困难;8分为单侧肢体(前肢或后肢)完全瘫痪,四肢拘挛,体重大幅减轻,不能进食;10分为濒死状态或死亡。本研究在行为学评分达2～8分的大鼠中随机抽取6只大鼠以TH免疫组织化学技术作组织学鉴定。

1.4 电针干预方法

大鼠造模成功后,给电针治疗各组大鼠穿上自制的鼠衣固定,参照余曙光等[9]主编的《实验针灸学》中大鼠常用的针灸穴位,取风府、太冲穴进行电针治疗。用0.30 mm×13 mm不锈钢针灸针,进针约4 mm,然后接G6805电针治疗仪,正极接风府穴,负极接太冲穴,采用连续波,刺激强度以大鼠腿部轻微抽动为度。每只大鼠治疗20 min,每日1次。正常组、假手术组、模型组大鼠每日在相同时间抓取固定,但不给予电针治疗,各组动物同步喂养。

1.5 标本采集

造模完成后,排除死亡、行为学评分不合格(评分＜2分或＞8分)的大鼠,每组均有12只纳入标本采集。将大鼠称重后用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,剂量为0.2 mL/100 g。各组大鼠随机选取6只行左心室多聚甲醛做内固定,取大鼠中脑黑质部组织块,并用4%多聚甲醛固定过夜,作石蜡包埋切片,用于形态学观察。另外6只大鼠待其完全麻醉后快速断头,于冰面上迅速取出脑组织并分离出中脑黑质组块,将分离的黑质组块用锡纸包裹放入液氮中速冻,然后取出组织放置在冻存管中于-80℃冰箱中保存,以备检测。

1.6 观察指标

1.6.1 黑质TH、a-syn的阳性表达

采用免疫组化法检测黑质TH、a-syn的阳性表达。将上述切片进行常规脱蜡处理,切片依次放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-95%乙醇-90%乙醇-80%乙醇-70%乙醇,然后入蒸馏水浸泡2 min。采用微波进行抗原修复;用蒸馏水新鲜配置的3%H2O2滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,PBS冲洗3次,每次3 min;加一抗于4℃湿盒中孵育过夜;加二抗,37℃孵育20 min,PBS冲洗切片3次,每次3 min;加DAB显色液,Harris苏木素复染,然后脱水,封片,在显微镜下观察,采集图像。

1.6.2 BIP、CHOP蛋白的表达

采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测BIP、CHOP蛋白的表达。取-80℃冰箱中冷冻保存的黑质组块,加入RIPA裂解液匀浆5 min,于4℃温度下,转速12000 r/min,离心30 min后,取上清液。用Bradford法测定蛋白浓度后,各个待检测样品取50mg的总蛋白,上样后PAGE凝胶电泳,根据各待检样品分子量的不同,BIP用8%的PAGE胶,CHOP用10%的PAGE胶。转膜(湿转法),转膜条件,BIP采用200 mA,120 min; CHOP采用300 mA,150 min。封闭用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜,室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗(BIP采用1:300稀释,CHOP采用1:200稀释),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4℃孵育过夜。然后孵育二抗,用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(1:50000稀释),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,室温摇床孵育2 h。显色曝光,TBST充分洗涤PVDF膜5～6次,每次5 min。每张膜滴加适量的ECL底物液,孵育数分钟。待荧光带明显后,用滤纸吸去多余的底物液,覆上保鲜膜,X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。采用BandScan软件对目标图像进行灰度分析,得出BIP、CHOP与b-action的相对吸光度值,并进行统计学分析。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用-分析,继用-检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分比较

表1 各组大鼠行为学评分比较 (±s,分)

注:与正常组、假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

造模完成后,排除死亡、行为学评分不合格(评分＜2分或＞8分)的大鼠,每组均有12只纳入检测统计。行为学评分结果显示,模型组大鼠评分较正常组和假手术组明显升高(＜0.01),电针治疗组和电针预治疗组大鼠评分较模型组显著降低(＜0.01),提示经鱼藤酮造模后的PD大鼠模型可出现明显的行为学改变,而通过电针干预能够明显改善其PD症状。详见表1。

2.2 各组大鼠黑质TH、a-syn平均光密度比较

使用IPP6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析,每张切片选取3张400倍照片,计算其平均光密度进行比较分析。结果显示,与正常组和假手术相比,模型组大鼠黑质区TH阳性表达显著降低(＜0.01),a-syn阳性表达显著升高(＜0.01);与模型组相比,电针预治疗组和电针治疗7 d、14 d、21 d、28 d组大鼠黑质区TH阳性表达显著升高(＜0.01),a-syn阳性表达显著减少(＜0.01)。正常组和假手术组大鼠黑质TH、a-syn阳性表达水平未见明显差异(＞0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠黑质内TH、a-syn平均光密度比较 (±s)

注:与正常组、假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.3 各组大鼠黑质内BIP、CHOP蛋白表达比较

表3 各组大鼠黑质内BIP、CHOP蛋白表达比较 (±s)

注:与正常组、假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

注:1为正常组;2为假手术组;3为模型组;4为电针预治疗组;5为电针治疗7 d组;6为电针治疗14 d组;7为电针治疗 21 d组;8为电针治疗28 d组

Western blot检测结果显示,模型组中脑黑质BIP、CHOP蛋白表达较正常组和假手术组显著增高,差异具有统计学意义(＜0.01)。与模型组相比,电针预治疗组和电针治疗7 d、14 d、21 d、28 d组BIP和CHOP蛋白表达水平显著降低(＜0.01)。正常组和假手术组BIP、CHOP蛋白表达水平未见明显差异(＞0.05)。详见表3、图1。

3 讨论

帕金森病是中老年人常见的一种中枢神经系统退行性疾病,虽然目前PD的发病机制尚不完全清楚,但大量研究结果表明PD是环境因素和遗传因素共同作用的结果。其典型的病理特征是中脑黑质致密部DA能神经元的变性缺失与残余神经元内嗜酸性包涵体LB的形成。TH是DA合成过程中的限速酶,其在黑质纹状体系统中的质量与DA能神经元密切相关,因此TH可以反映DA能神经元的状况[10]。LB的主要成分是a-syn,研究发现黑质神经元中a-syn蛋白的聚集与沉淀参与了PD的病理过程[1]。正常情况下a-syn的存在形式是可溶性的,它可以经过细胞自身的降解方式而清除,而PD患者黑质神经元中由于异常折叠或未折叠而聚集和沉淀的a-syn蛋白是不可溶的,因此也很难降解。这些异常的a-syn聚集过多时就会损坏内质网内环境的稳态,引起ERS[2]。

BIP是内质网分子伴侣蛋白,在辅助蛋白质加工合成、调节内质网应激信号中扮演着重要的角色。在一般生理情况下,BIP与内质网跨膜蛋白结合在一起,使它们处于失活状态。当各种因素诱发ERS时,BIP便会与跨膜蛋解离优先与内质网内集聚的错误折叠蛋白或未折叠蛋白结合以帮助新合成蛋白的正确折叠,减轻内质网负荷,试图恢复内质网稳态。当ERS过强或持续时间过长,内质网稳态无法恢复时,细胞就会启动凋亡程序,促使细胞凋亡[4-5]。CHOP是内质网相关促凋亡蛋白,在正常细胞中表达很低,但在ERS时被大量诱导表达,激活细胞凋亡途径[11-13]。CHOP广泛表达于哺乳动物机体细胞,其编码的蛋白与多种细胞功能活动(如增殖、分化、凋亡等)相关。Ji C等[14]通过灌喂乙醇实验发现,CHOP缺失型小鼠的肝细胞凋亡现象与野生型小鼠相比明显减少,另外一些与凋亡相关的基因也出现了变化,如CHOP野生型小鼠中下调的Jun D与Bc-l xl和Gadd45的上调。所有这些都证明CHOP基因在ER应激诱导细胞凋亡中具有重要作用,通过检测 CHOP蛋白表达的变化可以直观判断细胞凋亡的程度。

PD属中医学“颤证”范畴,中医学认为此证为本虚标实之证,以肝肾亏虚,髓海不足为本,实以风、火、痰、瘀为标。本病患者以中老年人居多,概因中老年患者年老体衰,肝肾不足,髓海空虚,不能濡养四肢所致。故“筋脉失养,风气内动”是本病的基本病机,治疗宜采取滋补肝肾,填精益髓,柔肝舒筋,祛风止颤之法。《素问·至真要大论》:“诸暴强直,皆属于风”“诸风掉眩,皆属于肝”。因此,本实验取风府与太冲相伍。风府归属督脉,为治疗内风之要穴,诚如《行针指要赋》:“或针风,先向风府。”且督脉为十二经脉之海,总督一身阳气,督脉从风府穴处入属于脑,故针刺风府不仅可以直达病所,祛风止颤,还有填精益髓之妙。太冲归属足厥阴肝经,为肝经之原穴,自古肝肾同源,故针刺太冲可有滋补肝肾、柔肝舒筋之效。

现在西药治疗PD主要以左旋多巴类药物为主,其短期疗效明显,但长期应用不仅疗效减弱,且毒副反应明显[15]。反观针灸在改善PD的运动症状、延缓病情进展、减轻药物的毒副反应、提高患者的生存质量方面有一定的优势[16]。本课题组在前期研究中发现电针可以保护PD模型大鼠中脑黑质神经元,抑制星型胶质细胞的活化,改善泛素-蛋白酶体系统功能,减轻谷氨酸释放引起的细胞毒作用,降低中脑黑质区炎性介质的表达[17-20]。本实验选用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制作PD模型,由于该模型能够选择性地引起黑质DA能神经元变性死亡和复制胞质内路易小体,因而较之MPTP等模型更好地模拟了PD的行为和病理特征[21]。本实验结果显示,模型组大鼠黑质内a-syn阳性神经元数量与BIP、CHOP蛋白的表达较正常组和假手术组显著增高,TH阳性神经元数量显著降低,说明在PD的发病过程中存在ERS相关信号的激活,并引起了DA能神经元的损伤。而在经过电针干预后,黑质内a-syn阳性神经元数量与BIP、CHOP蛋白的表达水平均显著降低,TH阳性神经元数量显著提高,说明电针风府、太冲穴可以有效抑制ERS相关蛋白的活性,保护DA能神经元。因此,电针防治PD的机制可能与电针能明显抑制ERS相关蛋白的表达,保护DA能神经元免于凋亡有关。

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Effect of Electroacupuncture on BiP and CHOP Expressions in the Substantia Nigra in a Rat Model of Parkinson Disease

,-,-,-,,.

,430065,

To investigate the effect of electroacupuncture on the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins in the substantia nigra in a rat model of rotenone-induced Parkinson disease.One hundred and twenty healthy male SD rats were randomized to normal, sham operation, model, electroacupuncture pretreatment, and 7-day, 14-day, 21-day and 28-day electroacupuncture treatment groups, 15 rats each. A model of Parkinson disease was made by subcutaneous injection of rotenone in the nape. The sham operation group received an injection of equal volume of sunflower oil emulsion. The normal, sham operation and model groups were not treated. The electroacupuncture treatment group received electroacupuncture at points Fengfu (GV 16)and Taichong (LR 3) after model making. The electroacupuncture pretreatment group received model making after 7 days of electroacupuncture treatment. TH anda-syn positive cells expressions in rat substantia nigra were determined by immunohistochemical method. BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra were examined by Western blotting.The model group rats had obvious syndrome characteristic of PD and rat behavior score decreased significantly after electroacupuncture intervention (＜0.01).a-syn positive cells expression and BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra increased significantly and TH positive cells expression in rat substantia nigra decreased significantly in the model group compare with the normal and sham operation groups (＜0.01).a-syn positive cells expression and BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra decreased significantly and TH positive cells expression in rat substantia nigra increased significantly in every electroacupuncture treatment group compare with the model group (＜0.01).The mechanism of electroacupuncture prevention and treatment of Parkinson disease may be related to its significant inhibition of the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins and protection of dopaminergic neurons.

Acupuncture therapy; Parkinson disease; Electroacupuncture; Endoplasmic reticulum stress; Immunoglobulin heavy chain binding protein; CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein; Rats

1005-0957(2018)01-0086-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.01.0086

国家自然科学基金项目(81473788,81403456);湖北省武汉市科学技术局高新技术产业科技创新团队计划项目(2014072704021262)

马骏(1964—),女,教授,博士,研究方向为针灸防治脑病及神经系统疾病的研究,Email:mj-1964@163.com

王述菊(1977－),女,教授,博士,研究方向为针灸防治脑病及神经系统疾病的研究,Email:361786273@qq.com

2017-08-21