脓毒症模型的研究进展

侯文肖，段 军

（中日友好医院 外科重症医学科，北京 100029）

脓毒症 （sepsis）是指由感染引起的机体器官功能障碍，同时伴随着多种细胞因子和炎性介质的诱导、合成与释放的综合征[1]。由于其病理生理机制较复杂，发病机制未能明确，使得临床治疗相对棘手，致使脓毒症在临床上拥有较高的病死率 （25%～30%），且其所致休克病死率高达50%[2，3]。研究分析表明，每年全球约有3150万人罹患脓毒症，死亡人数高达500多万[4]。同时，这也是导致ICU患者病死率较高的重要原因[5]。为了能够进一步地研究脓毒症的病理生理机制和指导临床治疗，就需要借助动物模型来模拟人类脓毒症。因此，本文就近五年常见的脓毒症动物模型的研究进展做一综述。

1 脓毒症的病理生理机制

脓毒症的致病机制尚未完全阐明，目前被研究者公认的是当机体受到创伤、感染甚至休克时，体内各种体液系统和细胞系统被激活，导致多种炎性介质和细胞因子的合成、表达和释放。通过炎症介质一系列的连锁反应，产生生物学放大效应，使炎症反应不断加重，引起局部和全身炎症反应的失控，使血管内皮细胞广泛损伤，进一步促进白细胞黏附并启动凝血系统，引起全身器官组织损害，最终导致多器官功能障碍。由于对其机制认识的有限性，因此在脓毒症的治疗上，应用抗炎介质和抗细胞因子临床实验大都不能取得满意的临床效果[6]。如果能够通过建立理想的脓毒症动物模型真实再现人类脓毒症的免疫系统改变，必然会对脓毒症病理生理机制的研究和临床治疗等工作产生十分重要的影响。

2 脓毒症动物模型的基本要素及理想模型

研究认为，良好脓毒症动物模型的制作需要具有以下必备要素：高排低阻血流动力学表现和高代谢状态；伴多个器官功能障碍；有较高的自然死亡率，依据脓毒症的病理转归，动物模型的自然死亡率要求达到50%～70%；脓毒症是严重感染等因素引起的机体炎症反应过度激活造成的自身损伤，不是因为细菌和内毒素对机体的直接作用，故出现器官功能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应具有相对的时间间距[7]。在临床上，脓毒症发生进展性器官功能障碍或衰竭一般需要几天甚至几周，然而制作的动物模型只需要短短几个小时或者几天就可以表现出来[8]。Hubbard等[9]认为理想的脓毒症动物模型应具备以下条件：脓毒症动模型的血培养均为阳性；脓毒症早期时表现为暖休克状态，即高血容量和高代谢的特点，晚期表现为冷休克状态，即低血容量和低代谢的特点；同时，动物模型最好既成本小，又要重复性好。

3 常用的脓毒症动物模型

综合近几年文献分析，常用的脓毒症模型主要分为3大类：（1）细菌感染模型，如动物体内注射活的病原体；（2）毒血症模型，如向动物注射脂多糖等毒素；（3）宿主屏障破坏性模型，如盲肠结扎一穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）及升结肠支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。下面详细介绍这三类常用的脓毒症模型

3.1 细菌感染模型

细菌注射模型多通过静脉、肌肉、腹腔内等不同途径向动物注射活的病原体，引起局部和全身炎症反应来达到引发脓毒症的临床表现。通过使用已知菌落的活病原体可以在很大程度上控制菌血症模型。输注活病原体的方式主要包括3种：（1）小剂量一次性输注；（2）小剂量持续输注；（3）大剂量一次性输注。利用这3种方式造模，都可以产生与脓毒症相类似的炎症反应及血流动力学变化。Van等[3]研究认为小剂量单次输注对动物模型诱发机体炎症反应较轻，器官功能损伤不是特别明显，使得死亡率很低。此种造模方法不符合脓毒症的临床预后规律，多已不被采用，而大剂量一次性输注会使动物模型的脏器过早衰竭及死亡；此种方式造模在血流动力学方面开始就表现为低排高阻，与脓毒症早期的高排低阻则相反；一般还没来得及启动炎症反应机制时，动物模型就已经死亡了。

小剂量持续输注能模拟细菌从感染部位持续释放入血的特点，让动物模型有足够的时间启动炎症反应机制，使促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）呈低水平升高，维持较长时间的高排低阻的血流动力学变化及高代谢状态，产生与脓毒症相似的病理生理状态及临床特征。Skorup等[10]利用这种方法向猪体内小剂量持续输注大肠杆菌，结果显示，在G-导致的脓毒症或休克的早期阶段，联合应用内酰胺类及氨基糖苷类抗生素可增强抗菌效果。然而，G+导致的感染在脓毒症中所占的比例逐年增加，尤以金黄色葡萄球菌居多[9]。G+活化Toll样受体2的主要成分是细菌脂蛋白（BLPs），通过活化核因子（NF）-KB 和 AP-1，促进机体释放炎症因子；同时磷壁酸（LTA）利用Toll样受体2减弱中性粒细胞表面的的CXCR2的表达，从而抑制中性粒细胞对细菌的清除，从而发生脓毒症[11]。李倩等[12]研究表明临床上脓毒症后期多是G+和G-合并感染，从而加重了患者病情，也增加了治疗难度。郭松喜等[13]通过微透析技术，分别研究正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位对药物的回收率，推算出不同靶部位的药物浓度，进而也为临床治疗开辟了一条新的道路。

3.2 毒血症模型

脓毒症动物模型最早使用的就是毒血症模型，20世纪90年代国外研究者发现了LPS结合蛋白（LBP），通过向动物体内注射内毒素—脂多糖（LPS）来诱发机体产生炎症因子，进而发展为全身的炎症反应，达到模拟人体脓毒症炎症反应机制的效果[14]。理论上，直接静脉输注脂多糖就可以造模。但是，综合文献报道关于毒血症的造模方式，根据向静脉输注的速度和单位量，也是分为小剂量一次性输注、小剂量持续输注和大剂量一次性输注三种方式。Johannes等[15]认为剂量的衡量标准应以降低早期血压和减少肾小球灌注为目标。陈明祺等[16]通过静脉小剂量持续输注LPS，建立小鼠脓毒症模型，为研究其炎症反应和免疫功能，分别于输注LPS后的特定时间段测定血清中的炎症介质浓度，测定单核细胞HLA-DR表达水平，并留取肠粘膜组织标本观察病理改变情况。研究结果提示四逆汤可调节全身炎症反应系统，促进感染性小鼠肠黏膜、肠功能和免疫功能的修复。有国外研究报道，脓毒症主要通过激活三条信号通路，介导适应性免疫或产生放大的级联反应，触发机体释放大量的细胞因子和炎性神经递质[17]，促使全身炎症反应综合征及代偿性抗炎反应综合征的发生，最终导致脓毒血症。DOI等[14]认为该模型并不能完全模仿人类脓毒血症，注射脂多糖只是早期引起细胞因子剧增，而炎症反应消失非常快，整个过程极其短暂。比如用抗肿瘤坏死因子和白介素-1治疗注射脂多糖的动物模型，治疗作用却并不理想。

3.3 宿主屏障破坏性模型

宿主屏障破坏性模型是使机体的保护屏障遭到破坏，让细菌和其他肠道内容物漏出、移位。腹腔感染是脓毒症患者最常见的感染源，且引起腹腔感染相对较容易，所以脓毒症常用的动物模型就是腹腔感染模型。早期腹腔感染模型是在动物腹腔内直接输注稀释的盲肠内容物、带有细菌的自体凝块或大肠杆菌。而现在的造模方式主要包括盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型和升结肠支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。LI等[18]认为盲肠结扎穿孔方法是评价脓毒症动物模型的金标准。因为CLP可以产生与人类脓毒症十分相似的炎症反应。血流动力学变化、免疫反应及生物化学的改变[8]。CASP模型比CLP模型产生的炎症因子反应更强及在血液的细菌数更多，此种模型主要用于研究弥漫性腹膜炎的病理生理特点和治疗方案。

盲肠结扎穿孔（CLP）模型：20世纪80年代Wichterman等把这种模型改良并推广，是现在应用最广泛的模型。盲肠里存在粪便，把盲肠结扎穿孔，使含有细菌的粪便不断进入动物腹腔致其腹腔感染，从而模仿临床上发生的腹膜炎及脓毒症。在制作CLP模型过程中，我们可以根据感染程度的不同结扎盲肠的不同部位，这也是CLP模型的其中一个优点，即能够造成不同严重程度的脓毒症[19]。Huber-Lang等[20]认为双阻断白细胞分化抗原14（cluster of differentiation 14，CD14）和补体 C5（complement C5）比单独阻断CD14或补体C5可以很大程度上增加脓毒症大鼠的生存率，因此，在以后的脓毒症治疗中，可以尝试特定的阻断CD14和补体C5，或许可以成为治疗脓毒症的一种新方法。到目前为止，临床上也没有可以明确诊断脓毒症及判断预后的敏感性或者特异性指标[21]。最近国内学者的一篇影响脓毒症预后因素的多元Cox回归模型分析表明，肠道术后、APACHEII评分、空腹血糖、HDL-C、BUN、Ca2+、LY、PLT和SOFA评分是影响脓毒症患者预后的独立危险因素[22]。国外有研究报道人参皂苷Rb1可以减轻脓毒症大鼠肺及肝的损害，使其生存率得到明显提高；其生理机制主要是通过改善动脉血压、下调TLR4-mRNA的表达及阻止 TNF-α 的生成[23]。

升结肠支架植入腹膜炎（CASP）模型：由于CLP模型可以形成腹腔内脓肿和脓毒症两种情况，但模型的坏死组织缺少像临床上手术切除的干预方式，后来研究者通过建立CASP模型解决了这个问题。Traeger等[24]研究表明升结肠支架植入腹膜炎（CASP）模型的严重程度与腹腔内放的支架的直径及脏器功能衰竭进程有关。升结肠支架植入腹膜炎（CASP）模型造成腹膜炎后会迅速发展为全身炎症反应综合征，随后发生的CARS让机体逐步进入低炎症反应状态。研究发现大鼠模型的肝脏中存在IL-10表达较多，TNF量较少，而在大鼠的肺中则相反；可以推测它在很大程度上调控着机体的免疫反应。BURAS等[25]研究发现临床中脓毒症患者的血浆IL-10、IL-6、TNF水平比CASP模型中明显降低，表明全身炎症反应综合征和代偿性抗炎反应综合征可能在机体的不同部位同时发生。

4 展望

虽然脓毒症动物模型的造模方式有多种，但是每一种脓毒症模型都有各自的优缺点，不能完全反应人类机体脓毒症的演变过程[26]。尽管如此，脓毒症模型的研究在指导脓毒症临床治疗中仍然发挥重要作用。由于脓毒症病理机制十分复杂，为了对其有更详细的认知，要求我们在制作动物模型过程中，依据实验目的不同，一定要在自己的研究中标注好这些明确因素。这样不仅可以让后期研究者得到有价值的信息，还可以让脓毒症动物模型的制作日趋完善。通过微透析技术研究正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率，推算出不同靶部位的药物浓度，这或许为脓毒症的研究提供了新思路。双阻断白细胞分化抗原14和补体C5可以使脓毒症大鼠的生存率明显提高，因此特异性的阻断CD14和补体C5，是否也可以成为临床上治疗脓毒症的一种新方法?希望以后制作的动物模型可以真实再现人类脓毒症，从而解决脓毒症临床治疗这一难题。