不同中药制剂微生物限度检查方法学的研究

李思 易伟 吴晶晶

[摘要] 目的 建立9种中药制剂的微生物限度检查方法。 方法 按《中国药典》2015年版四部通则1100生物检查法进行微生物限度检查方法的建立和验证。 结果 分别采用常规法、培养基稀释法和薄膜过滤法，各试验菌样品中的回收率均在0.5～2.0，符合《中国药典》要求。 结论 建立的方法准确可靠，可用于9种中药制剂的微生物限度检查。

[关键词] 中药制剂；微生物限度检查法；方法验证；抑菌作用

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（c）-0098-04

[Abstract] Objective To establish the microbial limit test for 9 kinds of traditional Chinese medicine preparations. Methods According to the Chinese Pharmacopeia 2015 edition 4th part general rule 1100 biological examination method， the microbial limit test method was established and verified. Results By using normal method， medium dilution method and membrane filtration method respectively， the recovery rate of each test bacteria sample was both up to 0.5-2.0， which met the Chinese Pharmacopeia requirements. Conclusion The established method is accurate and reliable， which can be used for the microbial limit test of 9 kinds of traditional Chinese medicine preparations.

[Key words] Traditional Chinese medicine preparation； Microbial limit test； Method validation； Antibacterial effect

口服中药制剂的微生物污染情况是其质量控制的重要指标，因此药品微生物检验和控制是其安全性保障的一项重要措施[1]。2015年版《中国药典》微生物限度检查法[2]参照美国药典[3]进行修订，在检验内容、检验方法和培养体系上都有很大改变[4-5]，新的微生物限度检查方法需要再次验证。

本研究按照《中国药典》2015年版四部通则1100生物检查法[2]的要求，分别采用常规法、培养基稀释法和薄膜过滤法对9种中药制剂进行微生物限度检查方法学的验证，从而保证用药的安全性和有效性，同时也希望为检验机构采用2015版《中国药典》进行微生物限度检查和微生物质量分析提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PYX-DHS-40×50型隔水式电热恒温细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PYX-DHS.500-BS型隔水式電热恒温细菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；MJ-Ⅱ型霉菌培养箱（上海恒科有限公司）；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器（雅马拓科技贸易有限公司）；苏Q/WS2-175-79型电热恒温鼓风干燥箱（连云港医疗器械设备厂）；MP1100B型电子天平（精密度：0.01 g，上海恒平科学仪器有限公司）；MP2001型电子天平（精密度：0.01 g，上海恒平科学仪器有限公司）；匀浆仪；开放式过滤器；双人操作台。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]。以上菌株均为第3代，均购自江苏省食品药品检验所。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：151028），胰酪大豆胨液体培养基（批号：151103），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：151022），沙氏葡萄糖液体培养基（批号：151022），麦康凯琼脂培养基（批号：1511092），麦康凯液体培养基（批号：1511092），肠道菌增菌液体培养基（批号：151112），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：151109），RV沙门菌增菌液体培养基（批号：151028），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：151027），蛋白胨（批号：141023）。上述培养基均为北京三药科技开发公司产品，中国食品药品检定研究院监制，均购自江苏省食品药品检验所。

1.4 试药

益肾丸（A，批号：160504、160510、160613），川丹灵胶囊（B，批号：151216、151224、151228），升血灵片（C，批号：160106、160304、160417），胃乐舒颗粒（D，批号：160616、160709、160811），气血双补口服液（E，批号：160720、160801、160822），消脂平片（F，批号：150827、151010、151229），肾炎宁片（G，批号：160715、160811、160909），复胆片（H，批号：160607、160711、160809），金保肾片（I，批号：151017、151223、160111），均由南京总医院制剂科提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌至10 mL胰酪大豆胨液体培养基中30～35℃培养24 h；接种白色念珠菌至10 mL沙氏葡萄糖液体培养基中20～25℃培养48 h；接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上20～25℃培养7 d，再用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释剂）将孢子洗脱，并过滤孢子至无菌试管内。取上述各培养物1 mL，用稀释剂10倍递增稀释，分别制成3000～10 000 cfu/mL的菌悬液（1 mL/皿）和15 000～50 000 cfu/mL的菌悬液（0.2 mL/皿）。

2.2 供试液的制备

2.2.1 计数用供试液制备

取供试品10 g或10 mL，加45℃稀释剂至100 mL，研匀。

2.2.2 耐胆盐革兰阴性菌检查供试液制备

取供试品10 g，至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，研匀。

2.2.3 沙门菌检查供试液制备

取供试品10 g，至200 mL胰酪大豆胨液体培养基中，研匀。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 常规法（1 mL/皿）

2.3.1.1 菌液组 取“2.1”项下3000～10 000 cfu/mL的菌悬液0.1 mL，加至10 mL稀释剂中，反复吹洗。取1 mL注入平皿中，加入约20 mL的培养基，测定菌落数。

2.3.1.2 试验组 取“2.1”项下3000～10 000 cfu/mL的菌悬液0.1 mL，加入到10 mL“2.2.1”项下的供试液中，其他操作同菌液组。

2.3.1.3 供试品对照组 取“2.2.1”项下液体1 mL注入平皿中，加入培养基，测定供试品的本底菌落数。

2.3.1.4 阴性对照组 取稀释剂1 mL分别注入平皿，加入培养基，作为阴性对照[6-9]。

计算各试验菌株的回收率，结果见表1。由表1可知，A、B、C、D、E可用常规法进行检查。F、G、H和I具有一定的抑菌性，需重新验证。

2.3.2 培养基稀释法（0.2 mL/皿）

2.3.2.1 菌液组 取“2.1”项下15 000～50 000 cfu/mL的菌悬液0.1 mL，加入到10 mL稀释剂中，反复吹洗。取0.2 mL注入平皿中，加入约20 mL的培养基，测定菌落数。

2.3.2.2 试验组 取“2.1”项下15 000～50 000 cfu/mL的菌悬液0.1 mL，加入到10 mL“2.2.1”项下的供试液中，其他操作同菌液组。

2.3.2.3 供试品对照组 取“2.2.1”项下液体0.2 mL注入平皿，加入培养基，测定供试品的本底菌落数。

2.3.2.4 阴性对照组 取稀释剂0.2 mL分别注入平皿，加入培养基[7-8，10]。

计算各试验菌株的回收率，结果见表2。由表2可知，培养基稀释法（0.2 mL/皿）可消除F的抑菌性，但G、H和I需采用薄膜过滤法重新验证。

2.3.3 薄膜过滤法

2.3.3.1 试验组 取“2.2.1”项下的供试液1 mL加至适量的稀释液中，混匀，过滤，用0.1%蛋白胨300 mL分3次冲洗滤膜，在最后1次冲洗液中加入不大于100 cfu的試验菌株，取出滤膜，滤膜菌面朝上贴于琼脂培养基表面培养，测定菌落数。

2.3.3.2 菌液组 取1 mL稀释剂代替供试品，其他操作同试验组。

2.3.3.3 供试品对照组 除不加试验菌外，其他操作同试验组。

2.3.3.4 阴性对照组 取1 mL稀释剂代替供试品，不加试验菌，其他操作同试验组[11-12]。

计算各试验菌株的回收率，结果见表3。由表3可知，采用薄膜过滤法5种菌种的回收率均在0.5～2.0，故可用薄膜过滤法检查。

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 大肠埃希菌

2.4.1.1 试验组 取“2.2.1”项下供试液10 mL及不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液1 mL，至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 h，取1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48 h。划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置30～35℃培养18～72 h。

2.4.1.2 阳性对照组 用稀释剂代替供试液，其他操作同试验组。

2.4.1.3 阴性对照组 用稀释剂代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。结果见表4。

2.4.2 耐胆盐革兰阴性菌

2.4.2.1 试验组 取“2.2.2”项下供试液，加入不大于100 cfu的大肠埃希菌（铜绿假单胞菌），混匀，20～25℃培养约2 h。再用胰酪大豆胨液体培养基稀释成1∶10、1∶100和1：1000供试液。分别取1∶10、1∶100和1∶1000供试液1 mL，分别加至10 mL肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48 h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上，置30～35℃培养18～24 h。

2.4.2.2 阳性对照组 用稀释剂代替供试液，其他操作同试验组。

2.4.2.3 阴性对照组 用稀释剂代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。结果见表4。

2.4.3 沙门菌

2.4.3.1 试验组 取“2.2.3”项下供试液，加入不大于100 cfu的沙门菌，混匀，30～35℃培养18～24 h，取0.1 mL接种于10 mL RV沙门菌增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24 h，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，置30～35℃培养18～48 h。

2.4.3.2 阳性对照组 用稀释剂代替供试液，其他操作同试验组。

2.4.3.3 阴性对照组 用稀释剂代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。由表4可见，试验组和阳性对照组能正常检出，阴性对照未检出，所以该方法可行。

3 讨论

本文按照《中国药典》2015年版四部通则1100生物检查法[2]要求，确立了9种中药医院制剂的微生物限度检查方法。其中，F、G、H和I均具有一定的抑菌性。查阅相关文献发现，F中含有黄芪、丹参。丹参酮类化合物对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性[13-14]。而黄芪对15种常见细菌具有一定的抑菌活性[15]。H中含有银杏叶，银杏叶对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用[16]。G和I中含有大黄，研究表明，大黄中的蒽醌类对葡萄球菌、链球菌有显著抗菌活性，同时大黄对幽门螺杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙眼衣原体等均有抑制作用[17-19]。

《中国药典》2010年版验证实验中，试验组是将试验菌和供试液同时加在平皿中，而2015年版是将一定浓度的菌加到供试液中混匀，再取定量的混合液到平皿中，这样更能模拟真实的药物受微生物污染的状态。

《中国药典》2015年版不再收载“离心沉淀法”，也有研究表明离心沉淀会对实验结果有影响[20]，因此本文采用薄膜过滤法。实验中，应取相当于1 g样品的供试液（即10 mL）进行薄膜过滤，但是由于中药固体制剂中含有大量的饮片细粉、辅料，直接过滤容易导致滤膜堵塞，而且滤膜上的中药残渣导致菌落计数无法进行。因此本文将取样量改为相当于0.1 g样品的供试液（即1 mL）进行试验，过滤效果较为理想，菌落计数也能顺利进行。

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（收稿日期：2018-03-08 本文编辑：张瑜杰）