洛贝林对慢性神经病理性疼痛的影响

杨宁 伏杰 尹家乐

[摘要] 目的 探讨洛贝林对慢性神经病理性疼痛的影响。 方法 采用随机数字表法将48只2月龄的小鼠分为4组，常规喂养。一组为空白对照组，其余三组均制备坐骨神经慢性缩窄性损伤模型（CCI）：模型组（CCI+腹腔注射生理盐水），小剂量洛贝林组（CCI+腹腔注射3 mg/kg洛贝林溶液），大剂量洛贝林组（CCI+腹腔注射6 mg/kg洛贝林溶液）。应用Von Fery机械测痛法及旷场实验于造模后第1、8、22天给药后测定小鼠痛阈及活动程度。 结果 痛阈值的测定中，与空白对照组比较，模型组在造模后第1、8、22天均下降（P < 0.05）；与模型组比较，三次实验中大剂量洛贝林组均有升高（P < 0.05）。旷场实验中，与空白对照组比较，模型组在第1、22天中总路程和平均速度显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，大剂量洛贝林组于造模后第22天总路程和平均速度均有显著提高（P < 0.01），活动次数明显提高（P < 0.05）。 结论 6 mg/kg洛贝林溶液能够使慢性神经病理性疼痛小鼠痛阈值升高，并且能够改善小鼠的抑郁样行为。

[关键词] 洛贝林；神经病理性疼痛；抑郁；旷场实验；痛阈

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of Lobeline on chronic neuropathic pain. Methods Forty-eight mice aged 2 months were divided into 4 groups by random number table method and fed routinely： one group was blank control group， and chronic constriction injury model of sciatic nerve were prepared in the other three groups； model group （CCI + intraperitoneal injection of saline）， low dose Lobeline group （CCI + intraperitoneal injection of 3 mg/kg Lobeline solution）， high dose Lobeline group （CCI + intraperitoneal injection of 6 mg/kg Lobeline solution）. The pain threshold and activity level of mice were measured by Von Fery mechanical pain measurement and open field test on the 1st， 8th， and 22nd days after injection. Results In the determination of pain threshold， the model group decreased on the 1st， 8th， and 22nd days after injection compared with the blank control group （P < 0.05）. While compared with the model group， the high dose Lobeline group was elevated in the three experiments （P < 0.05）. In the open field experiment， compared with the blank control group， the total distance and average speed of the model group significantly decreased on the 1st and 22nd days （P < 0.01）. Compared with the model group， the total distance and mean velocity of the high dose Lobeline group on the 22th day increased significantly （P < 0.01）， and the number of activities was improved （P < 0.05）. Conclusion The 6 mg/kg Lobeline solution can increase the threshold of mice with chronic neuropathic pain and improve the mice′s depression-like behavior.

[Key words] Lobeline； Neuropathic pain； Depression； Open field test； Pain threshold

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是人类最难治疗的疾病之一，其严重影响患者身心健康，降低患者生活质量，因其发病的机制尚未完全明确，严重阻碍了其治疗方法的研究进程。国际疼痛研究协会（IASP）将疼痛定义为一种不愉快的感觉和情感体验，它往往与实际或潜在的损伤相联系，或以患者受伤害的角度来进行描述的一种症状[1]。与此同时，NPP的发病率呈逐年上升的趋势，寻找新型高效的治疗措施是目前神经科学领域的热点[2]。临床上应用的主要一线药物有三环类抗抑郁药和抗癫痫药物，但多数治疗效果仍不令人满意[3]。有研究表明，烟碱型乙酰胆碱受体是治疗慢性神经病理性疼痛的重要靶点[4]。1526年，西班牙历史学家Oviedoy Valdes首先发现烟草可以缓解梅毒患者的疼痛[5]。20世纪烟碱从烟草中提取出来，并证实了其具有缓解疼痛的作用[6]。

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）主要分为神经型受体和肌肉型受体。前者作为镇痛治疗的相关靶点被重点研究。洛贝林是神经型nAChRs激动剂，其对慢性神经病理性疼痛的作用，尚缺乏相关研究。

神经病理性疼痛与抑郁之间存在共病联系。临床研究表明，30%的神经病理性疼痛患者表现出抑郁、焦虑状态，而50%的抑郁患者伴随疼痛症状[7]。慢性疼痛患者极易产生负面情绪，包括抑郁和焦虑，故抑郁和疼痛的病理性发病机制宏观上可能具有一致性[8]，两者存在许多可能的共同机制，如免疫激活、单胺能神经递质传递障碍、神经营养因子合成与分泌紊乱、基因与表观遗传学机制等[9]。本研究通过坐骨神经结扎法建立慢性神经病理性疼痛模型，探讨洛贝林对小鼠慢性疼痛及其引起的抑郁情绪是否有缓解作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

盐酸洛贝林注射液（上海禾丰制药有限公司，批号：06161105），DigBehv动物行为分析系统（上海吉量软件科技有限公司），Electronic Von Frey测痛仪（美国IITC公司）。

1.2 实验动物及分组

2月龄健康雄性昆明小鼠48只，体重25～40 g，由徐州医科大学动物中心提供（合格证号：SCXK苏2015-0009），标准化饲养。所有与动物饲养和操作都遵循国际动物保护协会和国际疼痛研究學会组织的相关规定，并获得徐州医学院实验动物伦理委员会批准。采用随机数字表法将48只小鼠分为4组，即空白对照组、模型组、小剂量洛贝林组、大剂量洛贝林组，每组12只。坐骨神经结扎造模成功后，模型组、小剂量洛贝林组、大剂量洛贝林组于每次实验前20 min分别腹腔注射生理盐水、3 mg/kg盐酸洛贝林溶液、6 mg/kg盐酸洛贝林溶液，给药体积为10 mL/kg。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠坐骨神经结扎模型的建立 依据Bennet方法[10]，对模型组、小剂量洛贝林组、大剂量洛贝林组大鼠制备坐骨神经慢性缩窄性损伤模型（CCI）。小鼠腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，于一侧后肢外侧剪毛备皮，碘伏消毒皮肤，沿股骨外侧做一纵形切口顺纹理钝性分离腿部肌肉，暴露并游离坐骨神经中上段8 mm，用4-0医用铬制羊肠线间隔1 mm结扎3处，结扎时以肢体轻微抽动为力度标准，使神经外膜轻度凹陷但不阻断血供，缝合，消毒。

1.3.2 机械痛阈测量 Von Fery法采用up-down法[11]于造模后第1、8、22天对各组小鼠的机械痛阈进行测定。将小鼠放入观察笼中15 min适应环境，以不同粗细的Von Fery纤维丝自金属筛网下垂直刺激小鼠患侧足底中部，持续4 s内小鼠有抬足、躲避或舔脚动作视为阳性反应，纤维弯曲90℃无抬足反应，视为阴性；从1.0 g开始，如出现阴性反应，继续给予相邻高强度的刺激，同一克数纤维丝反复操作5次，两次操作间隔5 min，发生3次或以上阳性反应的最小克数作为该动物的机械痛阈值，每次实验测量时间为12：00～14：00。

1.3.3 旷场实验 利用计算机控制的DigBehv动物行为分析系统（上海吉量软件科技有限公司），采用旷场实验对各组小鼠行为进行检测，时间固定在上午8：00～12：00进行，开放场区域为80 cm×40 cm分为9个象限，检测时间长度为4 min，由红外摄像系统和视频合成器记录小鼠的活动情况，计算机分析系统分析小鼠的运动轨迹，监视及分析活动次数、总路程、运动速度以观察其抑郁程度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t和SNK（S）-q检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验；同组不同时间点比较采用重复测量的方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械痛阈测定结果组间比较

四组小鼠痛阈基础值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白对照组比较，模型组造模后第1、8、22天的痛阈值明显下降（P < 0.05）；在第1、8、22天，大剂量洛贝林组与模型组比较，痛阈值升高且差异均有统计学意义（P < 0.05），与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 机械痛阈测定结果组内比较

空白对照组中，与第1天比较，第22天痛阈差异有统计学意义（P < 0.05）；模型组中，与造模后第1天比较，造模后第8天和第22天痛阈差异均有统计学意义（P < 0.05）；小剂量洛贝林组中，与造模后第1天比较，造模后第8天痛阈差异有统计学意义（P < 0.05）；大剂量洛贝林组中，与造模后第1天比较，造模后第8天和第22天痛阈差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 旷场实验结果

2.3.1 第1天结果 与空白对照组比较，模型组总路程缩短和平均速度下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，小剂量洛贝林组和大剂量洛贝林组差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.3.2 第8天结果 与空白对照组比较，模型组和小剂量洛贝林组总路程缩短和平均速度下降且差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，小剂量洛贝林组和大剂量洛贝林组差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.3.3 第22天结果 与空白对照组比较，模型组总路程缩短且差异有高度统计学意义（P < 0.01），平均速度下降（P < 0.05），而小剂量洛贝林组、大剂量洛贝林组与之对比，差异无统计学意义（P > 0.05）；与模型组比较，大剂量洛贝林组总路程延长、平均速度加快，差异有高度统计学意义（P < 0.01），活动次数减少，差异有统计学意义（P < 0.05），而小剂量洛贝林组差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

3 讨论

CCI模型作为最常用的NPP模型之一，其产生的疼痛症状和行为与NPP患者的临床表现很大程度上具有一致性，故广泛应用于NPP机制及镇痛药物的筛选研究[12]。

本研究模拟临床给药方式，通过在体实验评估洛贝林使用对小鼠慢性神经病理性疼痛的影响。洛贝林，又名山梗菜碱，是一种亲脂性的非吡啶生物碱，可激动N胆碱受体且可以通过血脑屏障，是一种呼吸兴奋药。Hama等[13]在行甲醛诱导的鼠疼痛模型中发现，N胆碱受体激动剂对急性或慢性组织损伤的疼痛均有镇痛作用，对慢性疼痛的镇痛效应相对更强。

本研究结果显示，坐骨神经结扎造模后测量痛阈值，与空白对照组比较，模型组造模后第1天和第22天的痛阈值下降，表明NPP小鼠模型造模成功；在造模后第1、8、22天，与模型组比较，小剂量洛贝林组的痛阈水平均有所增加但差异无统计学意义（P > 0.05），表明小剂量的洛贝林不能使NPP小鼠疼痛恢复到正常水平，仅起到部分缓解作用；与模型组比较，大剂量洛贝林组痛阈值升高，且差异有统计学意义（P < 0.05）；与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），表明大剂量的洛贝林可以充分改善小鼠的慢性神经病理性疼痛。研究显示，α4β2 nAChR分布最广，可通过调节多种神经递质如乙酰胆碱、多巴胺、γ氨基丁酸、去甲肾上腺等，在疼痛信号传递中发挥重要作用[14]，并且可以改善周围神经损伤引起的神经病理性疼痛[15]；Wieskopf等[16]認为α6 nAChR可能在介导疼痛感受的过程中发挥重要的作用；α7 nAChR作为治疗疼痛的潜在靶点已有相关研究报道，Papke等[17]发现α7 nAChR受体激动剂NS6740在坐骨神经慢性缩窄性损伤小鼠模型中具有镇痛作用；而α9α10 nAChR可能是慢性疼痛，特别是神经性疼痛的潜在作用靶点[18]。洛贝林作为神经型nAChR的激动剂，可能是通过激动神经型nAChR，经上述通路发挥缓解慢性神经病理性疼痛的作用。

有研究认为[19]，疼痛与抑郁之间具有共同的神经递质，如谷氨酸、P物质、5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺、脑源性神经营养因子等。临床实践发现，慢性疼痛患者中有近一半患者存在不同程度的抑郁、焦虑症状[20]。推测两者之间存在一定的相关性。

本研究显示，坐骨神经结扎造模后行旷场试验，与空白对照组比较，第1天模型组活动程度明显下降，表明NPP小鼠造模成功；造模后第22天模型组在总路程、平均速度的测量中相较于空白对照组有显著的降低，表明小鼠存在抑郁情绪；而在旷场实验中，与模型组的比较，大剂量洛贝林组3个指标数据结果均存在显著升高，表明洛贝林显著改善由慢性神经病理性疼痛所引起的抑郁。

综上所述，洛贝林能够激动N胆碱受体，从而缓解CCI小鼠的神经病理性疼痛，且对其伴发的抑郁情绪也有一定的缓解作用。这为临床上神经病理性疼痛和抑郁治疗提供了一定的理论支持。

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（收稿日期：2018-05-16 本文编辑：任 念）