苜蓿黄酮对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

占今舜，陈小连，詹康，苏效双，赵国琦*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200)

乳腺上皮细胞是合成和分泌乳汁主要场所，当奶牛该组织在金黄葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌等病原菌感染下，会产生乳房炎，进而导致产奶量和乳品质下降。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又称内毒素，是革兰氏阴性菌如大肠杆菌等细胞壁中的一种成分，当细菌死亡溶解时，其释放出来会使乳腺组织等产生损伤[1]。Shi等[2]研究发现，奶牛乳腺上皮细胞的活性随着LPS浓度和培养时间的延长而降低；细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性随着LPS浓度的升高呈降低趋势，而丙二醛(MDA)含量则呈升高趋势。Sun等[3]发现，奶牛乳腺上皮细胞在10 μg·mL-1LPS刺激下，其细胞膜的渗透性增加，促进细胞凋亡。朱丽萍等[4]发现，奶牛乳腺上皮细胞在1 μg·mL-1LPS处理3～24 h后可显著增加炎症因子(TNF-α和IL-1β)的表达。以上结果说明，LPS的刺激可促使乳腺上皮细胞的抗氧化能力下降，增加细胞膜的通透性，进而导致细胞凋亡。

黄酮类物质是含有2-苯基色原酮结构，以C6-C3-C6为碳架的一类化合物，是植物一种重要的次生代谢产物，广泛存在于植物的根、茎、叶和花、果实中[5]。张城等[6]研究发现，软骨细胞经LPS处理后，细胞增殖活性降低，细胞IL-1β、iNOS、P53基因mRNA的表达升高，而添加1 μg·mL-1金雀异黄酮能够提高增殖活性和降低这些基因的表达。姜念等[7]发现，4′,5,7-三羟基异黄酮能够拮抗人主动脉内皮细胞经LPS处理后引起的活力降低及ephrinB2和IL-6 mRNA的表达增加。另外，黄芪(Astragalusmembranaceus)总黄酮能够抗小鼠RAW264.7细胞经LPS诱导的炎症反应[8]。结果表明，黄酮类物质能够提高细胞活性，发挥抗炎症的作用。紫花苜蓿(Medicagosativa)被称为“牧草之王”，是一种豆科多年生草本植物。苜蓿中黄酮含量较高，据报道，45个紫花苜蓿品种中有70%以上品种的总黄酮含量为0.6%～0.9%[9]。之前研究发现，在正常培养和热应激情况下，添加75 μg·mL-1的苜蓿黄酮能够提高体外培养奶牛乳腺上皮细胞的活性，改善抗氧化能力和抑制细胞凋亡[10-11]。黄酮类化合物具有抗炎症作用，但不同种类可能作用存在差异。因此，本试验研究在LPS刺激下，苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响，为苜蓿黄酮的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

脂多糖(LPS，血清型O55:B5)购于美国Sigma公司，试验所用苜蓿黄酮和奶牛乳腺上皮细胞与文献[11]相同。

1.2 试验方法

1.2.1细胞活性检测 试验于2016年7月开始进行，细胞活性采用CCK-8法进行检测。试验方法如下：试验分为4组，即基础培养基(Con)、基础培养基中加入1 μg·mL-1的LPS(L)、基础培养基中加入1 μg·mL-1的LPS和75 μg·mL-1苜蓿黄酮(L+F)、基础培养基中加入75 μg·mL-1苜蓿黄酮(F)，每组5个重复，其中苜蓿黄酮用二甲基亚砜[DMSO(索莱宝，北京)]完全溶解，4个处理组中的DMSO含量低于2‰。在96孔板中，接种100 μL·孔-1的细胞悬液，悬液中含有1×104个的乳腺上皮细胞，然后在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养。待细胞完全贴壁后，去除培养基，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次后加入不同处理的培养基100 μL·孔-1。细胞培养12和24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(购于上海碧云天公司)，在培养箱中孵育3 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光值，然后计算细胞活性。

细胞相对活性=(As-A0)/(Ac-A0)×100%

式中:As为试验组的OD值；Ac为对照组的OD值；A0为空白组(只有培养基)的OD值。

1.2.2活性氧(ROS)的检测 细胞内的ROS采用DCFH-DA检测探针(购于南京建成生物工程研究所)来检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。取密度为1×105个·mL-1细胞接种到12孔板中，在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养24 h，去除培养基，PBS清洗两次，试验分组同上。细胞培养12 h后，去除细胞培养基，PBS清洗，然后加入含有DCFH-DA(稀释1000倍)培养基1 mL孵育1 h。细胞孵育之后，加入胰酶消化细胞(消化时间4 min)，加入培养基终止消化，制成悬液。将细胞悬液进行1500 r·min-1离心5 min收集细胞，然后用PBS清洗一次，加入200～300 μL PBS重悬细胞，然后用流式细胞仪进行检测，检测由扬州大学检测中心完成。

1.2.3炎症因子基因的检测 取密度为5×105个·mL-1细胞接种到6孔板，在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养24 h，去除培养基，PBS清洗两次，试验分组同上。细胞培养12 h后，去除细胞培养基，然后提取RNA。细胞RNA提取、cDNA合成和RT-PCR等的方法和条件同文献[12]。引物由Invitrogen公司合成，炎症因子相关基因引物序列见表1。

表1 引物设计Table 1 Primer design

1.2.4凋亡相关蛋白的检测 取密度为5×105个·mL-1细胞接种到6孔板，在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养，当每孔细胞铺满时，将培养基去除，PBS清洗两次，试验分组同上。细胞培养12 h后，去除细胞培养基，提取细胞蛋白，然后进行Western bolt检测。一抗：p53购于英国Abcam公司，GAPDH、p38、P-p38和Caspase3购于美国Cell Signaling Technology公司；二抗(羊抗鼠、羊抗兔)购于美国Cell Signaling Technology公司。检测方法如下：

1)根据蛋白分子量的大小配制相应的SDS分离胶(10%～12%)，将分离胶打入制胶板中，加入无水乙醇，室温放置40 min凝胶后，去除乙醇，加入浓缩胶，插入梳子后室温放置40 min。

2)将制好的胶转入电泳槽中进行电泳，蛋白样品上样量为30 μg，电泳条件为140 V，15 min；110 V，65 min。

3)根据蛋白分子量的大小和参照Marker进行切胶，铺膜，然后在电压100 V下转膜80 min。

4)转膜结束后，根据蛋白分子量的大小和参照Marker进行剪膜，然后进行封闭2 h，封闭结束后用杂交膜清洗液清洗3次。

5)加入一抗在冰上进行孵育12～16 h，结束后用杂交膜清洗液清洗3次。

6)加入二抗在摇床上孵育2 h，用杂交膜清洗液清洗3次后再用双色红外激光成像系统对膜进行扫描、成像，最后利用Image J软件进行灰度值分析，然后根据目的蛋白与GAPDH比值进行结果计算。

1.3 数据处理

基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行计算[13]，用Excel 2007进行试验数据处理，采用IBM SPSS Statistics 21.0单因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞活性的影响

从图1中可知，细胞培养12 h时，L组的细胞相对活性极显著低于其他各组(P<0.01)；培养24 h时，F组的细胞相对活性极显著低于对照组(P<0.01)，而显著高于其他两组(P<0.05)。结果表明，苜蓿黄酮能够抑制LPS刺激12 h细胞活性的下降。

2.2 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞ROS的影响

从图2中可知，与对照组相比，其他各组的ROS浓度极显著升高(P<0.01)；而与L组相比，L+F组和F组的ROS浓度显著降低(P<0.05)。结果表明，苜蓿黄酮能够降低LPS刺激下细胞内ROS浓度。

图1 苜蓿黄酮对LPS刺激12和24 h下奶牛乳腺上皮细胞活性的影响Fig.1 Effect of alfalfa flavonoids on cell viability of BMECs induced by LPS for 12 and 24 h

图2 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞内ROS水平的影响Fig.2 Effect of alfalfa flavonoids on the level of ROS in BMECs induced by LPS

Con为对照组、L为脂多糖组、L+F为脂多糖加苜蓿黄酮组、F为苜蓿黄酮组。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。Con is the control group, L is the LPS group, L+F is the LPS and alfalfa flavonoids group, F is the alfalfa flavonoids group. Values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.3 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞炎症因子基因表达的影响

从表2中可知，与对照组相比，L组IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88的表达均极显著升高(P<0.01)，而F组无显著性差异；与L组相比，L+F组IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)和TLR2(P<0.01)的表达显著降低。结果表明，苜蓿黄酮能够下调LPS刺激下细胞炎症因子的表达，提高细胞的抗炎症作用。

表2 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞炎症因子基因表达的影响Table 2 Effect of alfalfa flavonoids on gene expression of inflammatory factors in cells stimulated by LPS

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note: In the same row, values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.4 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞凋亡蛋白表达的影响

图3 Western blot 结果Fig.3 The results of Western blot

利用软件对图3的条带进行计算，结果见表3。与对照组相比，在LPS刺激下，p53(P<0.01)、Caspase3(P<0.01)、p38(P<0.05)和P-p38(P<0.01)蛋白的表达显著升高，而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达(P<0.05)。与对照组相比，在没有LPS刺激下，添加苜蓿黄酮显著升高了Caspase3蛋白的表达。结果表明，LPS能够促进细胞凋亡蛋白的表达，而苜蓿黄酮能够下调LPS刺激下细胞凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡。

表3 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞凋亡蛋白表达的影响Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on expression of apoptosis protein in cells stimulated by LPS

3 讨论

脂多糖能够降低细胞的存活率，抑制细胞增殖。刘立新等[14]研究发现，LPS能够抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。王亨等[15]发现，添加100 mg·L-1的LPS能够显著抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本试验得到相似结果。之前的研究发现[10-11]，在正常培养和热应激下，添加苜蓿黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞活性。之前有报道称，奶牛乳腺上皮细胞活性随LPS浓度的升高呈下降趋势，且随着培养时间的延长，活性也呈下降趋势[2]。研究发现，低浓度雌激素能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖，并可以提高SOD活性来发挥抗氧化作用，而高浓度则抑制细胞增殖和降低抗氧化能力，引起细胞损伤[16]。而紫花苜蓿黄酮以木犀草素、槲皮素、染料木黄酮等黄酮类物质为主，而这些物质均能发挥植物雌激素的作用[17]，在本试验中，苜蓿黄酮能够提高LPS刺激12 h奶牛乳腺上皮细胞的活性，而对刺激24 h的效果不明显。可能是因为LPS作用时间太长对细胞损伤较大，而且苜蓿黄酮随着培养时间的延长可能发挥类雌激素作用，进而抑制细胞的增殖。说明苜蓿黄酮能够减缓LPS对细胞的损伤，而且可能存在时间依赖性。LPS能够导致奶牛乳腺上皮细胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低，而升高MDA含量[2]。而之前试验发现[10-11]，苜蓿黄酮能够提高细胞抗氧化酶类的活性，因此，苜蓿黄酮提高细胞活性可能与其提高细胞抗氧化能力有关。

LPS是一种重要的炎症反应因子，能够诱导TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等细胞因子参与炎症反应。Chanput等[18]研究发现，槲皮素、杨梅酮、圣草酚、柚皮素、芦丁和芹黄素均能够降低单核细胞炎症因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-8和IL-10基因的表达。另外，黄芪总黄酮、染料木黄酮和芫花总黄酮均能够抑制RAW264.7细胞TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的分泌，从而发挥抗炎[8,19-20]。本试验结果与其相似，表明苜蓿黄酮亦发挥了抗炎症的作用。Toll样受体家族(TLRs)能够与不同病原体相关分子模式结合，导致下游目的基因的活化，进而诱导免疫应答的发生。在此过程中存在两种信号转导通路，即依赖MyD88和非依赖MyD88。除TLR3为非依赖MyD88，其他均为依赖MyD88[21]。Li等[22]研究发现，芒果苷能够抑制LPS诱导口腔上皮细胞TLR2和TLR4的过表达，抑制NF-κB、p38和JNK的表达。Feng等[23]发现，大豆黄酮能够抑制LPS诱导小鼠肺组织的TLR4、MyD88的过表达和NF-κB活性。Sun等[24]研究发现，黄芩苷可能通过抑制TLR2和TLR4/MyD88/p38/NF-κB信号来达到抗炎作用。另外，山姜素可能通过抑制TLR4调节NF-κB信号通路来发挥抗炎作用，从而抑制LPS诱导小鼠发生乳房炎[25]。从本试验的结果来看，苜蓿黄酮降低了TLR2和MyD88基因表达和p38蛋白表达。结果说明，苜蓿黄酮可能通过抑制TLR2/MyD88/p38信号，降低炎症因子的表达，从而达到抗炎症的作用。

张宸豪等[26]研究发现，随着LPS浓度增加，RAW264.7细胞内ROS的水平也增加。本试验也发现，在LPS刺激下，细胞内的ROS浓度升高。邓伟等[27]研究发现，橙皮素能够抑制LPS诱导H9C2心肌细胞ROS产生，说明黄酮类物质具有降低细胞ROS浓度的功能。从本试验结果来看，在LPS刺激下，苜蓿黄酮发挥抑制细胞内ROS产生的作用，这可能与其提高细胞抗氧化酶类活性有关。细胞内的ROS能够与细胞膜的双磷脂分子层及膜蛋白相结合，增加细胞膜通透性，导致DNA受损，进而促使细胞凋亡和死亡。Caspases家族中的大多数成员是开启细胞凋亡的效应子，其中Caspase 3被认为是凋亡的关键蛋白酶，其一旦被激活，细胞凋亡就不可避免。从本试验结果看，在LPS刺激下，苜蓿黄酮虽降低细胞Caspase-3蛋白的表达，但未达到显著性差异，说明苜蓿黄酮对Caspase-3蛋白的表达影响不大。然而，在正常培养下，苜蓿黄酮显著提高了细胞Caspase-3蛋白的表达，原因可能是苜蓿黄酮发挥了类雌激素作用，导致细胞氧化，提高ROS浓度所致。p53是一种抑癌基因，其主要功能是通过促进DNA修复蛋白的转录合成来完成DNA损伤的修复。当该修复无法完成时，p53会促使凋亡相关蛋白如Fas、Apaf-1、Bax等的表达，进而导致细胞凋亡。另外，p53能够与Bcl-xL、Bcl-2的结合或者直接结合并激活Bak，诱导Bak寡聚，进而导致细胞色素C释放和促进细胞凋亡。细胞内的ROS浓度增加，会促使p53基因表达升高，进而促进细胞凋亡[28]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是丝氨酸/苏氨酸激酶高度相关的蛋白激酶超家族，其是细胞内一种重要的信号传导系统，能够被LPS所激活。p38MAPK能够通过提高c-myc表达、磷酸化p53、参与Fas/Fasl介导的凋亡、诱导Bax转位和增强TNF-α表达等来促进细胞凋亡[29]。从本试验发现，在LPS刺激下，p53和p38蛋白的表达升高，而添加苜蓿黄酮能够抑制它们的表达。说明在LPS刺激下，苜蓿黄酮可能通过降低细胞内的ROS浓度，抑制p53和p38蛋白的表达，进而抑制细胞的凋亡。

在LPS刺激下，苜蓿黄酮能够降低奶牛乳腺上皮细胞内ROS的浓度，抑制p53和p38等凋亡蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡，提高细胞活性。另外，苜蓿黄酮可能通过抑制TLR2/MyD88/p38信号，进而降低TNF-ɑ、IL-1β和IL-6等炎症因子基因的表达，从而发挥抗炎症的作用。

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