甲状腺乳头状癌BRAF V600E基因突变与临床病理特征相关性研究

王维娜， 曹燕珍， 陈海霞， 张 焕， 房新志

(新疆医科大学附属肿瘤医院病理科， 乌鲁木齐 830011)

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约85%～90%是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)，鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)作为甲状腺乳头状癌诊断和预后的分子生物学标志及开发治疗甲状腺乳头状癌的靶基因，其基因突变是甲状腺癌研究领域中的热点。目前部分研究显示BRAF V600E基因突变型甲状腺乳头状癌临床侵袭性较强，临床分期更高，更易复发及淋巴结转移[1-2]，另有部分研究认为BRAF V600E基因突变与甲状腺乳头状癌的临床病理特征的相关性仍存争议[3]。 本研究采用实时荧光定量PCR(real-time PCR) 法检测110例甲状腺乳头状癌患者及38例甲状腺良性病变患者BRAF V600E基因突变情况，旨在探讨甲状腺乳头状癌患者的临床病理特征与基因突变之间的相关性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象收集2016年1月-2016年8月在新疆医科大学附属肿瘤医院110例甲状腺乳头状癌患者的手术标本，选取38例甲状腺良性病变作为对照，样本的获得均经过患者知情同意，标本均经 10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋、组织切片后经常规病理诊断确诊，收集临床病理资料，所有患者术前未行内、外科放射治疗，患者除甲状腺乳头状癌外未发现其他恶性肿瘤。110例甲状腺乳头状癌患者中48例行甲状腺全叶切除术，患侧叶、狭部及部分对侧叶切除术36例，26例行患侧叶及狭部切除；100例患者行中央区或侧颈淋巴结清扫，4例患者未清扫淋巴结，另有6例清扫的中央区淋巴结为脂肪组织，未见淋巴结结构及肿瘤； 96例患者行优甲乐治疗，14例行左旋甲状腺素片治疗，11例行131I全身显像及碘放射治疗。38例甲状腺良性病变包括结节性甲状腺肿13例，淋巴细胞性甲状腺炎15例，滤泡性腺瘤10例；女性31例，男性7例；年龄28～52岁，中位年龄40.5岁。甲状腺乳头状癌及甲状腺良性病变HE染色如图1所示。

a: 包裹性乳头状亚型(×100倍) 肿瘤有完整的纤维包膜包绕(如→所示)，可见经典的乳头状结构 b: 包裹性滤泡亚型(×40倍) 肿瘤有完整的纤维包膜包绕(如→所示)，可见滤泡状结构 c: 浸润性乳头状亚型(×100倍)肿瘤可见经典的乳头状结构(如所示)，在周围甲状腺组织(如→所示)中浸润性生长 d: 浸润性滤泡亚型(×100倍) 肿瘤可见滤泡状结构(如所示)，在周围甲状腺间质(如→所示)中浸润性生长

e: 结节性甲状腺肿(×40倍)

f: 淋巴细胞性甲状腺炎(×40倍)

g: 甲状腺滤泡性腺瘤(×40倍)

图1甲状腺乳头状癌及甲状腺良性病变HE染色结果

1.2检测方法

1.2.1 DNA提取 切取8 μm厚切片5张，对照最后1张HE切片选取肿瘤范围，确保肿瘤细胞数量≥200个，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(50) DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，德国，Cat.No.56404,Lot No.145035990)提取基因组DNA,具体操作步骤按试剂盒说明书进行，经核酸定量分析仪测定DNA纯度及浓度。

1.2.2 基因突变检测 采用北京雅康博公司人BRAF基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)检测BRAF基因V600E点突变情况，操作按照使用说明书进行，用荧光定量PCR检测仪(安捷伦MX3000P，美国)按照试剂盒说明书进行PCR扩增。

1.3统计学处理使用 SPSS 18.0软件进行卡方检验统计学分析, 对于理论频数>5的，采用皮尔逊卡方值评价 BRAF 基因突变与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系；对于1<理论频数<5的，采用连续校正卡方值；对于理论频数<1的，运用Fisher′s精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

38例甲状腺良性病变均未发现突变，突变率为0%；110例甲状腺乳头状癌患者中93例存在BRAF V600E基因突变，突变率为84.54%，甲状腺乳头状癌患者BRAF V600E基因突变率高于甲状腺良性病变患者BRAF V600E基因突变率，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。BRAF基因突变与不同性别、年龄、女性患者是否绝经、多发病灶、直径大小、是否伴淋巴细胞性甲状腺炎、不同组织学亚型、包裹性或浸润性、是否伴随钙化、淋巴结转移情况均无关(P>0.05)；与甲状腺被膜外侵犯、临床高分期有关(P<0.05)(图2、表2)。

表1 甲状腺良、恶性病变中BRAF基因突变率

a: 样本扩增曲线升起(有扩增信号)，说明该样本在该位点上发生突变，检测结果为突变型。

b: 样本扩增曲线未升起(无扩增信号)，说明该样本在该位点上未发生突变，检测结果为野生型。

图2 实时荧光定量PCR法检测BRAF基因V600E突变

注:*为1<理论频数<5， 使用连续校正卡方值。

3 讨论

BRAF基因属于RAF家族成员，参与RAS-RAF-有丝分裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶(MEK)-细胞外信号调节激酶(ERK)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的信号转导，BRAF基因突变被认为可引起上述通路持续失控，从而导致细胞过度增殖、分化及肿瘤形成。在BRAF可识别的众多基因突变中，最常见的是发生于15外显子上第1799位核甘酸T-A的转换，导致编码位于第600位缬氨酸(V)被谷氨酸(E)所替代(V600E)，从而激活了MAPK途径，导致了肿瘤的发生[4]。BRAF V600E基因突变被认为是甲状腺癌发生过程中最常见的遗传学事件，尤其在甲状腺乳头状癌中发生率最高,达29%～88%[5-6]。研究发现V600E点突变在甲状腺良性病变中突变率为0%，可以帮助鉴别良恶性甲状腺乳头状增生的诊断[7]。本组研究中结节性甲状腺肿、淋巴细胞性甲状腺炎及甲状腺滤泡性腺瘤未检测到BRAF V600E基因突变，110例甲状腺乳头状癌中BRAF突变率达84.54%，这一检测结果高于国内外一些研究[8-9]，可能与地区差异及样本数量有限有关。

WHO(2013)肿瘤组织学分类中，甲状腺乳头状癌被定义为：显示滤泡上皮分化特征的甲状腺恶性上皮性肿瘤，典型者含有乳头和滤泡结构以及特征性的细胞核。甲状腺乳头状癌病理亚型较多，其中最常见的是有乳头状结构的经典型及以滤泡结构为主的滤泡亚型，镜下根据有无完整的纤维包膜，分为包裹性及浸润性，间质可有不同程度的纤维化及钙化。王炜等[10]研究发现，BRAF突变在甲状腺乳头状癌中的组织学表现更多倾向于“经典型”和“浸润性”，而“滤泡亚型”和“包裹性”形态的甲状腺乳头状癌则有较低的BRAF突变率，高表达RAS突变。本组BRAF突变率在滤泡亚型和经典型、包裹性和浸润性及肿瘤是否伴钙化组间未发现明显差异(P>0.05)，由于病例数较少，未发现高细胞亚型、柱状细胞亚型及弥漫硬化亚型等少见亚型。

有研究认为合并淋巴细胞性甲状腺炎的甲状腺乳头状癌淋巴结转移率较低， BRAF V600E阳性率低，预后好于单纯性甲状腺乳头状癌[11-12]。本组28例(28/110)伴有淋巴细胞性甲状腺炎的甲状腺乳头状癌中BRAF突变率与单纯甲状腺乳头状癌间无明显差异(P>0.05)。最新的一项Meta分析显示BRAF V600E 基因突变与患者的年龄、性别、肿瘤大小和甲状腺被膜是否受侵犯、淋巴结转移和临床分期等有显著相关性，它是目前公认的甲状腺乳头状癌预后的重要预测因子[13]。高分化甲状腺癌提示预后不良的因素包括：诊断时>45岁、男性、肿瘤>4 cm和甲状腺外浸润、淋巴结转移等，然而关于 BRAF V600E基因突变与 甲状腺乳头状癌 的侵袭性生物学关系研究报道间还存在较多的争议，秦东广等[14]研究发现BRAF突变仅与肿瘤直径大小(≥1 cm与<1 cm)有统计学差异。吴永芳等[3]应用Taqman-ARMS方法检测106例甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变在年龄<49岁、被膜无浸润或转移和临床分期Ⅰ或Ⅱ中较高(P<0.05)。洪玉蓉等[15]研究认为BRAF突变型与野生型在中央区淋巴结转移、包膜侵犯、肿瘤数目、直径大小、是否伴发淋巴细胞性甲状腺炎组间差异并无统计学意义(P>0.05)。有研究发现BRAF V600E点突变与年龄(≥45岁)，直径≤1 cm及肿瘤被膜外侵犯有关[16]。本组BRAF突变率在性别、年龄、多发病灶、直径大小、中央区淋巴结转移等差异均无统计学意义(P>0.05)，而在甲状腺被膜外浸润、较高的临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)中，BRAF有较高的突变率，差异有统计学意义(P<0.05)。

鉴于甲状腺乳头状癌有较高的BRAF突变率，在甲状腺结节细针穿刺抽吸活检(FNAB)的基础上，结合BRAF基因检测，已成为术前甲状腺乳头状癌特异性较高的诊断方法之一，Tang等[17]报道检测甲状腺乳头状癌组织及其术前FNAB细胞的BRAF V600E基因突变，其结果符合率高达90%，由于BRAF基因突变者具有较高的复发率和淋巴结转移率，术前通过基因检测还可以预测甲状腺乳头状癌的临床病理结局，方便临床医生在早期即可制定合理的手术方案和术后治疗。

本组研究旨在初步探讨甲状腺乳头状癌BRAF基因突变情况，我们认为BRAF V600E基因突变可能与甲状腺乳头状癌侵袭性的生物学行为有一定相关性。

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