基于Wnt/β-catenin信号通路的中医药干预骨关节炎的研究进展

谢晚晴 郑洪新

辽宁中医药大学，沈阳 辽宁 110847

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由于增龄、肥胖、劳损、创伤等诸多因素引起的退行性骨关节病，是由于关节退行性改变导致软骨、滑膜、关节囊等结构产生的慢性无菌性炎症。本病发病机制尚未明确，患者病变严重阶段活动受限，生存质量降低，除关节置换无其他有效的治疗手段。Wnt/β-catenin信号通路可以调节胚胎期软骨发育,以及出生后关节软骨的成熟、分化以及凋亡,对软骨外基质分解代谢亦有着重要的作用[1,2]。因此,目前的研究认为Wnt/β-catenin信号通路可能是导致骨关节炎的重要信号通路之一[3]。

1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt家族由许多富含半胱氨酸的小型分泌蛋白组成,主要参与调控多种重要的细胞活动，包括胚胎发育、细胞迁移及细胞分化等[4-6]。Wnt通路激活了4个细胞内途径，本文关注的是经典Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin 信号通路激活起始于Wnt蛋白与其受体复合物结合，受体复合物包括低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5,6 以及卷曲蛋白(Fz)家族。二者结合后，细胞内散乱蛋白(Dvl)活化，轴蛋白(Axin)与 LPR 5 或 LRP 6 的胞质尾区结合。 Axin的关键组成是糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)，因此信号通过 Dvl 抑制 GSK-3β 活性， 抑制 β-catenin 的分解并在细胞内聚集，促使β-catenin入核，进而与转录因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)结合，调节 cyclin D1、cmyc 等数个靶基因的表达[7,8]。而当缺少Wnt蛋白启动因子刺激时，β-catenin与Axin，APC，GSK3等形成复合体，β-catenin被CK1 和GSK-3β磷酸化，细胞质中游离状态的β- catenin减少，导致细胞核中的 Wnt 靶基因转录被抑制[9]。除正向启动子，Wnt/β-连环蛋白信号通路中还有一些重要的负向调节因子[10]。最常见的三个为抑制因子 Dickkopf 1(DKK 1)，硬化蛋白(sclerostin，SOST)和分泌型 Fz相关蛋白(sFRP)。DKK 1可结合 LRP 5 和DKK 1 受体 Kremen，进而抑制和降解三元络合物；SOST可结合 LRP 5从而阻止其与 Wnt 结合；sFRP可结合 Wnt，阻止其与受体复合物结合。

2 中医药通过调控Wnt/β- catenin信号通路干预骨关节炎的研究

2.1 中医药通过调控Wnt/β- catenin信号通路干预软骨细胞的研究

软骨细胞在关节软骨内合成软骨基质，是关节软骨中分泌II型胶原蛋(Collagen II)与聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的唯一细胞,所以软骨细胞的退变程度决定OA的病理变化[11]。近期研究发现, Wnt/β- catenin信号通路失调可以导致软骨细胞增殖、分化及凋亡的异常，从而出现软骨的破坏，导致骨关节炎的发生。而这种失调分为两种，一种是指软骨细胞中β-catenin的过表达导致未成熟软骨分化、成熟和软骨基质降解。研究发现建立软骨细胞过表达β- catenin基因的小鼠模型,发现该小鼠会出现下颌关节炎、腰椎间盘关节炎及膝骨关节炎等表现，模型鼠的关节软骨全层缺失、软骨下骨区有新的编织骨形成，软骨组织表面纤维化、出现垂直的裂隙、软骨赘和骨赘的形成[12-14]。同时，亦有研究[15]指出OA患者血清中的β-catenin是上调的，退变的软骨细胞内β-catenin增多。另一种失调是指软骨细胞β- catenin信号被抑制，导致软骨细胞凋亡，关节软骨破坏。Zhu等[16]研究发现抑制软骨细胞中β-catenin能导致软骨细胞凋亡和关节软骨破坏,而且软骨的破坏与年龄相关。由此可见，Wnt/β-catenin信号通路可能参与软骨细胞的增殖、分化，而在骨关节炎患者及动物模型中Wnt/β-catenin信号通路是被激活的。

1)单味中药提取物

中药以补肾、活血药为主，包括姜黄素、牛膝多肽、淫羊藿素、补骨脂素、龙须藤多肽等，这些中药的提取物通过激活Wnt/β-catenin通路促进软骨细胞增殖。如盛旭飏[17]和马勇[18]等研究证明姜黄素通过上调Wnt2，β-catenin并下调GSK-3β，激活Wnt通路促进软骨细胞的增殖。然而陈琼[19]等对姜黄素的研究结果与上述研究结果相反，认为姜黄素对人关节炎软骨细胞和正常人软骨细胞增殖具有明显抑制作用，并且对关节炎软骨细胞中的MMP-13、IL-6具有抑制作用。还有研究显示牛膝多肽[20]、补骨脂素[21]、龙须藤多肽[22]能够上调Wnt4、Frizzled-2、β-catenin 和cyclin D1, 并下调GSK-3β，从而激活Wnt通路促进软骨细胞的增殖，同时能够增加软骨细胞中二型胶原蛋白表达。这些研究者可能考虑，当关节炎出现软骨受损的情况，促进软骨细胞增殖可以缓解部分症状。然而Church等[23]研究发现在软骨细胞成熟分化阶段，Wnt 4过表达会持续激活Wnt/β-catenin 信号通路并导致生长板软骨细胞肥大，加速软骨细胞的终末分化[24]，因此成年小鼠关节软骨细胞Wnt/β-catenin 信号通路的激活可能会因软骨细胞过早分化而导致关节炎的加重[25]。

2)中药成方

中药成方多为补肾或补肾活血方，如骨痹通方[26]可能通过抑制 Wnt5a与β-catenin 的表达，延缓白介素1β诱导的软骨细胞凋亡。透骨消痛胶囊[27]含药血清可能通过下调Wnt4，上调GSK-3β协同降低大鼠软骨细胞的β-catenin表达，抑制TNF-α诱导的软骨细胞凋亡。另有研究证明透骨消痛胶囊[28]及其拆方可下调Wnt 4、β-catenin、MMP13的表达，对白细胞介素 1β诱导的软骨细胞具有协同保护作用。陈秀明[29]等证明壮骨健膝方含药血清对IL-1β诱导的退变软骨细胞有保护作用,可能与促进GSK-3、DKK-1, sFRP-3的表达,使进入核内的β-catenin减少,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

这些研究均证实与正常软骨细胞相比，经炎性因子诱导的软骨细胞中的β-catenin表达增多，这些中药成方可能通过下调WNT4、WNT5蛋白或β-catenin从而下调Wnt/β-catenin信号通路或其下游靶基因起到保护软骨细胞的作用。

2.2 中医药通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预滑膜细胞的研究

大部分对骨关节炎发病机制的研究主要针对关节软骨和软骨细胞的病理改变，对关节滑膜的炎性改变并未重视，甚至认为它只是骨关节炎发病过程中的继发性改变[30]。然而近年来随着研究的深入，有学者认为滑膜炎症在骨关节炎的发展过程中起重要作用，并且其严重程度与OA进展程度存在相关性[31]。因此，滑膜有望成为治疗骨关节炎的新靶点[32]。

作者检索到的研究均采用中药成方作为干预手段，其中针对补肾活血方有三个研究，宋鹏飞[33]等采用 GSK-3β选择性抑制剂作用于正常人滑膜细胞以激活Wnt/β-catenin 信号通路，结果发现MMP-2、MMP-7 和 MMP-9、β-catenin和Cyclin D1都显著升高，证明补肾活血方能明显下调滑膜细胞核蛋白β-catenin、MMP-7和Cyclin D1的表达。袁琴[34]等研究证明补肾活血方能明显下调大鼠膝骨关节炎滑膜细胞中MMP-7、胞核β-catenin 的表达。肖志锋[35]等研究证明补肾活血方可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路，下调共培养体系中MMP-7,CTX-Ⅱ,COMP的表达，减轻异常滑膜细胞对软骨细胞的损害，减缓软骨基质的降解，有利于骨关节炎的缓解和恢复。另外，赵婧[36]等研究表明祛痰化瘀利湿方能够明显下调人滑膜细胞 β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的表达，提示从单一信号通路方面可阐释祛痰化瘀利湿方治疗骨性关节炎的分子作用机制。

由上述研究中可见，关节滑膜炎症产生的炎性递质既可以直接作用于关节软骨，还可以作用于调节关节软骨代谢的一些细胞因子和蛋白酶，一方面直接导致关节软骨结构发生改变，破坏和降解软骨基质，另一方面，使一些细胞因子和蛋白酶发生理化作用，加速关节退变的过程[37-39]。

2.3 中医药通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预骨关节炎动物模型的研究

除体外实验外，还有部分研究者运用不同手段制备骨关节炎动物模型，运用中医药疗法对其进行干预，研究其对Wnt信号通路的作用，使得研究更加贴近临床。

1)中药单体

曾丽[40]等采用Hulth 法建立大鼠膝骨关节炎(KOA)动物模型，给予中药单体淫羊藿苷干预，发现其能下调大鼠膝骨关节炎模型软骨组织 MMP-1、MMP-3、MMP-13、P-p38、P-ERK1/2、P-JNK 及β-catenin的蛋白表达水平，改善大鼠膝骨关节炎(KOA)动物模型软骨组织，并且对软骨细胞有一定保护作用。高堪达等[41]用前交叉韧带切除法(ACLT)建立小鼠骨关节炎模型，亦给予淫羊藿苷干预，结果发现淫羊藿苷能显著降低软骨MMP-1、MMP-3、MMP-8和MMP-13及Adamte5,IL-1b和TNF-α的mRNA表达。

有研究认为，基质金属蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖酶(aggrecanases)，这两种蛋白酶对关节软骨主要基质成分Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的降解是导致OA 产生的主要原因[42]这两种基因可被Wnt信号通路调节，属于Wnt信号通路下游靶基因。其中基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13 均可发挥降解软骨基质所有成分的作用；研究发现，MMP-1、MMP-8、MMP-13 能够高效降解胶原纤维Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中 MMP-13 是促进基质降解的关键酶，尤其对Ⅱ型胶原有优先消化作用。而聚蛋白多糖酶ADAMTS-4和 ADAMTS-5可促进蛋白聚糖的分解代谢。上述研究也有通过下调这两种蛋白酶，抑制其对Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的降解，起到治疗OA的作用。

2)中药成方

中药成方主要通过下调Wnt信号正向调节因子Wnt蛋白或β-catenin，从而抑制Wnt信号下游通路靶基因基质金属蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖酶(aggrecanases)。或通过上调负调节因子DKK1和SOST，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。

调控正向调节因子的中药成方有骨灵膏[43]及其拆方，该方可对冷固法诱导的关节炎大鼠模型有保护作用，可以明显下调 Wnt2、β-catenin、LRP-5 蛋白表达，进而抑制MMP-13对软骨ECM的降解。吴追乐[44]等采用木瓜蛋白酶双膝关节腔注射准备OA大鼠模型，结果显示透骨消痛胶囊能降低软骨中 Wnt-4、β-catenin以及MMP-13及ADAMTS-5的含量的表达。郑文伟[45]等采用改良Hulth法建立OA动物模型，结果显示跳骨片能降低滑膜中 Wnt-4、β-catenin 以及 MMP-13含量。梁祖建[46]等通过切除双侧卵巢并切断右侧膝交叉韧带建立骨关节炎动物模型，结果显示Wnt2、β-catenin、GSK-3β在模型组中表达明显增强，补肾活血中药能下调Wnt2、β-catenin、GSK3β的表达。阚卫兵[47]等采用Hulth法建立家兔膝骨关节炎模型，采用 Affymetrix Rat 230 2．0 Array 芯片检测滑膜组织的基因表达变化，结果显示模型组滑膜组织 MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP12 表达明显高于正常组滑膜组织，补肾活血方及自拟补肾活血方[48]对其有明显下调作用。李翠葳[49]等采用改良 Hulth 法构建大鼠膝骨关节炎模型，结果显示模型组Wnt4 水平升高，WIF1水平下降，而益气养血方能逆转这两个Wnt蛋白的含量。丰哲[50]等采用石膏伸直位固定8周法制作兔膝骨关节炎(0A)模型，独活寄生汤通过下调wnt3a、β-catenin，抑制MMP13对软骨基质的降解，从而发挥软骨保护作用。

调控负向调节因子的研究有吴海华[51]等采用改良膝关节腔内注射木瓜蛋白酶法制作大鼠OA模型，发现DKK-1在OA中的表达显著高于正常组，并且DKK-1含量随病程的进展逐渐增加。消骨痛汤通过抑制IL-1β及DKK-1的表达，缓解OA病情进展。

3)电针、针刀、超声波及针刺疗法

目前的干预手段除了中药疗法还有电针、针刀、超声波及针灸疗法，直接作用于Wnt/β-catenin信号通路的研究有，李洪涛[52]等证明电针可能是通过下调 Wnt3a、β-catenin 蛋白表达、抑制 Wnt 信号通路，进而保护受损的关节软骨，改善膝关节骨性关节炎大鼠的关节结构和功能状态。艾海波[53]等证明电针治疗能减轻关节软骨的受损程度，其机制可能与降低软骨细胞中β-catenin 的表达，进而间接抑制其下游炎性基因转录有关。

其他研究均是对Wnt信号通路下游靶基因基质金属蛋白酶(MMPs)有调节作用，如李卫平[54]等证明超声波和电针治疗均能降低KOA兔软骨中MMP-1的表达。郑秀存[55]等亦发现针刺、电针和温针能不同程度降低MMP-1表达。刘苗苗[56]等证明电针下调对膝骨关节炎模型大鼠滑膜组织中MMP-3。蹇睿[57]等发现电针能减少兔膝骨关节炎模型的MMP-13表达, 可促使兔骨关节炎模型软骨细胞重新排列，对OA治疗有一定作用。

2.4 中医药通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预骨关节炎临床研究

有少量研究者观察了中医药对膝骨关节炎患者的作用，进一步从临床角度证明中医药调控Wnt/β-catenin通路可能是防治骨关节炎的关键。临床研究干预手段有中药成方、电针或中药配合针灸疗法，但是由于伦理的限制等原因，所以临床研究数量较少。中药干预研究有唐萌芽[58]等纳入膝骨关节炎患者30 例，采用补肾活血中药治疗膝骨关节炎，能改善膝关节功能，缓解患者疼痛，降低患者静脉血中Wnt-5a、β-catenin、BMP-2 mRNA表达量。詹宏钢[59]等纳入42例膝骨关节炎患者,予独活寄生汤治疗12周，同样证明发现独活寄生汤能通过降低患者静脉血中Wnt-5a、β-catenin、BMP-2 mRNA表达量,发挥保护关节软骨、缓解疼痛的治疗效果。电针研究有诸剑芳[60]等入组60例老年膝关节炎患者，将其随机分为电针组和西药组，治疗四周后，电针组与治疗前自身相比，血清 MMP-3值下降。中药配合针灸治疗有潘明柱[61]等选取风寒湿痹型关节炎患者112例，其中56例给予温经通络汤联合针灸治疗，对照组给予塞来昔布联合来氟米特治疗，结果显示温经通络汤结合针灸治疗风寒湿痹型关节炎疗效显著，其可下调Wnt-3a，β-catenin，BMP-2 表达，缓解关节疼痛及改善关节功能。还有分不同证型进行基础研究的乔斌[62]等选取膝骨关节炎患者20例，其中非阳虚质膝骨关节炎患者10例，阳虚质膝骨关节炎患者10例，正常非膝骨关节炎健康志愿者对照组10例，膝骨关节炎患者关节组织中β-catenin、MMP13表达均上调。

3 展望

近十年来中医药通过基础研究和临床研究对骨关节炎分子机制的阐明做了很大贡献，并且中医药对骨关节炎的疗效确切、治法多样。本文总结了基于Wnt/β-catenin信号通路的中医药干预骨关节炎的研究进展，结论如下：1)目前有效的中医药治疗手段包括中药内服和中医外治，内服中药包括单味中药提取物、经典成方、临床效方。中医外治法包括针刺、电针、温针、小针刀和超声波疗法。2)中医药调节Wnt/β-catenin通路的途径包括：上调Wnt蛋白及Wnt通路关键因子β-catenin促进软骨细胞增殖；下调Wnt蛋白及Wnt通路关键因子β-catenin，抑制在骨关节炎模型组过表达的Wnt/β-catenin通路，从而下调其下游靶基因基质金属蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(aggrecanases)，抑制其对Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的降解，起到治疗OA的作用。

相关研究越来越多，但是仍存在一些问题：1)针对不同疾病，相同的中医药疗法可激活亦可抑制Wnt/β-catenin 信号通路，这有可能说明中医药对该通路可能有双向调节作用，但这个理论还有待进一步研究。2)有些文献中评价Wnt/β-catenin信号通路是否被激活或抑制的证据不足，不能充分证明β-catenin是否入核，该信号通路是否真正被激活或者抑制。3)关于中医药调控 Wnt/β-catenin信号通路在骨代谢中的详细作用机制还有待深入探讨，如Wnt家族中其他蛋白或非经典Wnt信号通路是否参与此过程，以及该通路与 BMP、Notch、FGF、MAPK 等其他信号通路之间是否有交互作用。4)现阶段的干预手段多局限于单味中药或含药血清，因为中药复方的成分复杂，有效成分难以分离、提取，这些问题阻碍了中医药基础研究的进展。

相信随着实验手段的发展和对Wnt/β-catenin信号通路调控骨关节炎作用机制的逐渐阐明，针对 Wnt/β-catenin 信号通路的靶点治疗可能成为骨关节炎治疗的突破点，并推动中医药防治骨关节炎的发展。