土家药红黑二丸的研究进展△

2018-01-19杨德泉

中国民族医药杂志 2018年5期

杨德泉

(湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南　吉首　416000)

红黑二丸，又名红白二丸、岩丸子、鸳鸯七、山海棠，为秋海棠科植物中华秋海棠Begonia grandis Dry subsp. sinensis (A. DC.) Irmsch的块茎，是一种常用的土家族民间药材。土家医药理论认为，红黑二丸性微冷，味酸、辣。具有赶火止泻，活血疗伤，止血等功效。土家医临床用于热泻症、心口痛、跌打伤痛、血热出血、痢疾、淋浊、白浊、毒蛇咬伤等病症[1,2]。中医药理论认为，红黑二丸性微寒、味甘苦，具有活血化瘀，止血凉血，消肿解毒的功效。适用于吐血、咳血、咯血、崩漏、月经不调、跌打损伤、痢疾、白带等[3]。近年来，一些学者对红黑二丸的显微鉴别、化学成分、药理作等方面进行了的研究，现综述如下。

1　生药鉴定

叶丛进等[4]报道了对红黑二丸药材的生药鉴定研究。红黑二丸的性状为：块茎呈扁圆球或不规则块状，直径0.7～3cm。表面棕红色至黑褐色，有不规则的皱纹。上端凹窝状，偶有叶柄残留基，下方常残留须根。质坚实，不易折断，断面类白色或淡红棕色，粉性，散在微小的亮星。气微，味微苦。

根茎的横切面结构特征为：木栓细胞4～6层列，切向延长，表面观长方形或多角形。木栓细胞外侧有时可见表皮细胞，表皮细胞外侧附有角质层，表皮细胞内侧常有受挤压的薄壁细胞。木栓层内为薄壁细胞区，其内散生给你管束，维管束中导管束明显。皮层、中柱和髓部无明显分界。薄壁细胞中含淀粉粒，有的含有簇晶或集合成簇的细小晶群。研究认为，以上特征可作为中华秋海棠根茎鉴别的依据。

郑丽慧等[5]基于ITS2序列建立红白二丸药材及其近缘易混品的分子鉴定方法。方法是收集67份红白二丸药材(中华秋海棠)及其近缘易混品(秋海棠、掌裂叶秋海棠和柔毛秋海棠)，提取总DNA、PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，通过CodonCode Aligner V4.2.1对测序序列进行质量分析和拼接，采用MEGA 6.0进行多序列比对分析，并基于最近距离法和建树法(NJ树和UPGMA树)对红白二丸药材及其近缘易混品进行物种鉴定。结果：最近距离法和建树法的结果均表明，中华秋海棠与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠能有效区分，但其与秋海棠未能区分开(秋海棠与中华秋海棠为原亚种与亚种的关系)。结论：ITS2序列可以有效区分红白二丸药材及其近缘易混品的物种基原，可以作为红白二丸药材的分子鉴定方法，为红白二丸药材的真伪鉴别和保证临床用药安全提供有效的技术支持。

2　化学成分

李丹平[6]采用紫外、红外、高效液相及气质-联用对提取得到的红黑二丸中的甾醇类物质进行了结构表征。结果是，分离纯化后的植物甾醇都表现出了甾醇的特征峰，而且干扰较少，分离纯化效果较好；GC-MS结果显示，红黑二丸中的甾醇类物质有四种：β-谷甾醇(含量43.42%)、豆甾醇(含量11.68%)、豆甾-5，24(28)-双烯-3β-醇(含量11.23%)、麦角甾-5-烯-3β-醇(含量9.13%)。

涂志超[7]对不同采收期、不同产地的红黑二丸，采用溶剂法提取分离，回收各有效部位溶剂，得到正丁醇、乙酸乙酯提取物。利用LC-MS的方法建立了红黑二丸正丁醇、乙酸乙酯提取物的指纹图谱，同时鉴定了红黑二丸正丁醇提取物中9种黄酮苷类成分，分别为：槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖-木糖苷阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-鼠李糖-鼠李糖苷、皂草苷；乙酸乙酯提取物中7种黄酮类成分，其中6种成分是首次从红黑二丸中鉴定得到，分别是：表儿茶酸、表儿茶醛、原花青素b1、原花青素b2、表儿茶素、儿茶素。4种成分是首次从秋海棠属药用植物中鉴定得到，分别是：原儿茶醛、儿茶素、原花青素b1、原花青素b2。

3　提取工艺

李丹平[6]研究了红黑二丸中甾醇类物质的提取工艺。采取溶剂结晶法、超声波法及超临界CO2萃取法等三种方法比较了提甾醇类物质的效果，结果以超声波法提取率最高，为84.4%(含量为0.76mg/g)。采用单因素试验和正交试验优化了红黑二丸中的甾醇类物质的提取工艺，结果最佳提取条件为药液比1：24，提取温度为55，提取时间为5min，提取得到的红黑二丸中的甾醇含量为1.78mg/g；并采用HPLC对红黑二丸中的甾醇类物质进行了分析。以吸附率作为评价指标，采用单因素试验优化了硅胶吸附红黑二丸中甾醇类物质的最佳工艺。最佳吸附时间2.5h，吸附温度35℃，吸附液浓度为0.4mg/mL，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1，红黑二丸中甾醇类物质的吸附率为87.54%。

高丽等[8]报道，使用超声波提取法对中华秋海棠进行提取，利用改进的Liebermarn - Bur chard比色法对秋海棠根茎超声波提取物中的甾醇进行定量分析，研究了料液比、温度、时间和提取溶剂4个因素对秋海棠根茎中甾醇含量的影响，选取提取温度、提取时间和料液比为影响因子，采用3元2次旋转正交设计，对超声提取工艺进行优化，计算回归方程，并进行响应面分析，同时采用高效液相色谱法分析其甾醇种类，结果甾醇提取的最佳工艺条件为：提取温度58℃，提取时间57 min，料液比1:44(g/mL)；在此条件下，中华秋海棠中甾醇含量为1.80 mg/g。高效液相色谱分析显示，中华秋海棠含有β-谷甾醇及其他种类甾醇。认为超声波辅助提取法能提高提取效率，是一种节能、省时的好方法，作为中华秋海棠根β-谷甾醇提取的新工艺，具有良好的应用前景。

4　含量测定

涂志超[7,9]建立了测定红黑二丸及其非药用部位茎、叶中5种黄酮和酚酸类成分(原儿茶酸、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素和芦丁)含量的UPLC分析方法。采用acquityuplchsst3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，以甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脱，流速0.2ml·min-1，检测波长280nm，柱温30℃。结果表明所有样品5个成分均达到基线分离，线性关系良好，原儿茶酸、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、芦丁的加样回收率分别为：99.45%、96.92%、99.69%、98.42%、99.75%(rsd均小于5%)。该方法简便、准确、灵敏度高，能较好的反映红黑二丸的质量情况，为红黑二丸的后续开发利用提供参考依据。

高丽等[8]采用比色法和高效液相色谱法对中华秋海棠提取物中的甾醇类化合物进行了定量分析，液相法测得中华秋海棠提取液中β-谷甾醇的得率为1.05mg/mL，比比色法测得的总甾醇含量小，说明中华秋海棠中还可能含有其他甾醇化合物。

蒋佳雯等[10]采用液相法，测定中华秋海棠地下部分的芦丁含量为0.034%。吴家红等[11]采用液相法测定中华秋海棠地下部分的β-谷甾醇含量为0.11%。

5　药理作用

5.1防治高血脂和动肪硬化李丹平[6]研究证实，红黑二丸甾醇类物质对实验性小鼠高血脂症和动脉硬化具有较好的预防和治疗作用。

5.2治疗慢性盆腔炎涂志超[7]报道了对红黑二丸治疗慢性盆腔炎药效物质基础研究。利用抑制LPS刺激小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)分泌炎性介导因子的抗炎作用模型，研究红黑二丸不同提取物的抗炎作用。通过细胞毒实验筛选药物实验浓度，利用炎性刺激物大肠杆菌型LPS刺激细胞，检测受试物抑制细胞分泌炎性介导因子TNF-α、IL-1β及NO的作用。结果表明：经LPS诱导的炎症模型组TNF-α、IL-1β及NO含量显著升高，红黑二丸乙醇提取物及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物能显著抑制TNF-α、IL-1β及NO的生成与释放。由此可初步推断红黑二丸乙醇提取物及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物具有一定的抗炎作用，作用机理与调节巨噬细胞产生各种炎症因子TNF-α、IL-1β及NO有关。通过研究红黑二丸正丁醇、乙酸乙酯提取物对慢性盆腔炎模型大鼠的影响，探讨其作用效果及初步机理。将Wistar大鼠除假手术组(只手术不造模)外，其余大鼠建立慢性盆腔炎模型(机械损伤加混合菌感染)，造模7d后，随机分为模型组、红黑二丸正丁醇提取物高和低剂量组、红黑二丸乙酸乙酯提取物高和低剂量组、阳性对照组，共7组，每组动物8只，连续给药14d后(假手术及模型组同法灌胃蒸馏水)，分别进行子宫肿胀度检测、子宫病理组织学检查及血清il-2、il-6水平测定。结果表明红黑二丸正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物均能明显抑制子宫肿胀、改善子宫炎症程度、促进炎症大鼠Il-2、Il-6水平恢复至正常水平。结果表明红黑二丸能有效地减轻大鼠子宫炎症，其作用机理与抑制炎性因子有关。

5.3促凝血徐元翠等[12]报道，取小鼠和大鼠随机均分为对照组和红黑二丸组，红黑二丸组灌胃给于红黑二丸提取物1 mL/100 g bw，对照组灌胃给于等体积生理盐水，qd，连续给药7 d后，分别测定小鼠出血时间(BT)、血凝血时间(CT)、大鼠的活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)、全血浆凝块溶解时间及血小板数(PLT)。结果：与对照组相比，红黑二丸提取物能明显缩短BT，降低CT、APTT和PT。同时，红黑二丸提取物能使全血浆凝块溶解时间延长、血小板数增高。证明红黑二丸具有明显的促凝血作用。

5.4活血化瘀习忻等[13]采用直接给药的试验方法，在给药后30min、60min、90min等不同时间，用WX-9型微循环显微镜观察小鼠耳廓微细动、静脉口径、毛细血管交叉网开放数量等指标的变化。结果：红黑二丸能明显增大正常小鼠耳廓微细动、静脉口径，增加毛细血管开放数目，改善微循环(P<0.01)。证实红黑二丸具有显著改善小鼠耳廓微循环作用，为该药活血化瘀作用提供实验依据。

5.5抗炎镇痛姚勇等[14]采用急性和慢性呼吸道炎症模型探索红黑二丸甾醇提取物的抗炎作用和靶点。利用昆明小鼠吸入香烟烟雾，制作急性肺损伤模型，用不同浓度的红黑二丸甾醇提取物处理，HE染色检测肺组织病理学变化，Elisa检测TNF-α，MPO的变化，Western blotting检测cPLA2蛋白的表达，结果显示，制造急性肺损伤模型后，小鼠肺叶片状变实，肺泡腔广泛缩小或消失，肺泡间隔增厚，大片炎性细胞浸润、肺泡壁的毛细血管充血，TNF-α，MPO，cPLA2的表达增加，给药后少量炎性细胞浸润，肺泡膈明显，肺泡壁的毛细血管充血状态明显减轻，TNF-α，MPO的分泌减少，同时cPLA2的表达降低(P<0.05)。利用卵白蛋白(OVA)诱导BALB/c小鼠产生支气管哮喘制作呼吸道慢性炎症模型，用不同浓度梯度的红黑二丸甾醇提取物处理，HE染色检测病理学变化，Elisa检测IL-4，IL-5，IL-13的变化，Western blotting检测cPLA2蛋白的表达，结果显示，制作支气管哮喘模型后，肺部血管和支气管周围大量炎细胞渗出，支气管杯状细胞大量增生，IL-4，IL-5，IL-13，cPLA2的表达增加，给药后，炎细胞减少，杯状细胞增生减少，IL-4，IL-5，IL-13的分泌减少，cPLA2的表达降低(P<0.05)。以上急慢性呼吸道炎症的实验结果表明红黑二丸甾醇类提取物量效依赖地通过抑制cPLA2抗呼吸道炎症。

王世华等[15]采用二甲苯造成小鼠耳廓肿胀、大鼠棉球肉芽肿实验观察红黑二丸提取物的抗炎作用；通过小鼠甲醛致痛实验观察其镇痛作用。结果：红黑二丸提取物能够较明显抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀，抑制大鼠棉球肉芽肿的增重，减少小鼠在注射甲醛后0～5 min，15～30min两个时相内舔足时间、减轻甲醛所致小鼠足跖肿胀。结果显示红黑二丸提取物具有较明显的抗炎镇痛作用。

5.6抗心肌损伤姚勇等[16]报道， western blot检测不同H/R时间点iPLA2蛋白的表达，确定H/R的时间点；在H/R的基础上，用不同浓度梯度的红黑二丸甾醇提取物处理细胞，western blot检测iPLA2蛋白表达，MTT法检测细胞存活率，试剂盒检测LDH、SOD、MDA、TNF-α的含量，流式细胞术检测凋亡。结果：H60min/R30min，iPLA2蛋白表达最高(P<0.01)，红黑二丸甾醇提取物量效依赖地降低了其蛋白表达，同时降低H/R时LDH、MDA、TNF-α的含量，减少凋亡，提高SOD的活性及细胞的存活率(P<0.05)。结论：红黑二丸甾醇提取物能通过iPLA2量效依赖地抗心肌细胞H/R损伤。

5.7止泻丁家森等[17]报道，将72只小鼠随机分为6组：空白对照组、大黄煎液阳性对照组、复方高、中、低剂量实验组、蒙脱石散组.小鼠给予灌胃大黄煎液，构建急性腹泻模型，再分别给予高、中、低剂量复方煎液和蒙脱石散溶液，观察比较各组小鼠腹泻指数。结果：复方各剂量组腹泻指数明显低于大黄煎液阳性对照组(P<0.05)，中剂量组效果最为明显。结果显示红蜈蚣七和岩丸子复方水煎液均有较好的止泻作用。

5.8其它作用李丹平[6]采用测定POV值的方法研究β-谷甾醇、微胶囊化-谷甾醇及VE在猪油中的抗氧化效果，结果，微胶囊化β-谷甾醇具有较强的抗猪油油脂氧化能力，其抗氧化效果优于β-谷甾醇和VE；甾醇抗氧化交果呈剂量效应，剂量越大，其抗氧化效果越明显。红黑二丸甾醇类物质对供试的金色葡萄球菌、枯草芽杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌及志贺氏菌均有一定的抑菌效果，且都随着甾醇浓度提高，抑菌作用越明显。红黑二丸甾醇类物质对霉菌具有一定的抑菌效果，且对黑曲霉和橘青霉抑制效果相当。