骨髓增生异常综合征中自噬失调及中医药干预相关研究进展

陈海琳，周永明，陆皓，孙伟玲，王怡超，吴志豪，李昌桂，徐静

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，以无效造血和高风险向急性白血病转化为特征，表现为形态上病态造血和外周血血细胞减少[1]。临床上以单系或多系血细胞减少为主要表现[2]。MDS发病机制至今仍不明确。

自噬(autophagy)是一种高度保守的经溶酶体介导的对细胞内蛋白质和细胞器进行降解、维持细胞内环境自身稳定的过程，是细胞面临营养缺乏或应激状态时的自我保护机制[3]。自噬参与生物过程的各个方面，包括细胞存活、死亡、增殖、分化、衰老和癌变[4-5]。 近年来的一些研究表明，自噬异常与MDS发生发展密切相关，自噬可以调节细胞的形成、增殖、能量代谢等诸多方面。通过调节自噬失衡有可能成为治疗MDS的新思路。现就目前MDS中自噬及相关中医药研究作一介绍。

1 自噬的功能、分类及过程

自噬的生理功能主要是维持细胞内稳态及维持细胞存活。依据自噬过程中底物进入溶酶体的途径，可以被分为三类：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy CAM)[6]。巨自噬即是通常意义的自噬，是自噬最常见的类型，本文中的自噬均指巨自噬。自噬过程主要包括：起始、延伸、成熟、自噬体与溶酶体融合和降解等步骤[7]。自噬是一种起始于称为PAS(pre-autophagosomal structure, 自噬体前结构)的泡状过程[8]。PAS首先在酿酒酵母中被鉴定，并被认为是吞噬泡(phagophore)的前体。但尚未确定PAS是否存在于哺乳动物细胞中。吞噬泡或隔离膜募集、容纳所有诱导自噬所需的Atg(自噬相关)蛋白。吞噬泡扩大并隔离胞质成分，最终成为双膜囊泡，即自噬体。自噬体与内涵体融合形成自噬性液泡(amphisome)，然后其与晚期内涵体和溶酶体融合成为自溶酶体(autolysosome)。自溶酶体与晚期内涵体和溶酶体的直接融合也可能发生。这个过程导致隔离内容物的降解，降解产物可以被细胞重新利用[9]。

在哺乳动物中，HSC(造血干细胞)衍生的早期祖细胞成熟为红细胞，主要在BM(骨髓)中从幼红细胞开始，去核后成为网织红细胞。新形成的网织红细胞在外周循环中进一步发育成红细胞，在红细胞中完成蛋白质合成，获得双凹形状并去除所有剩余的细胞器，主要是线粒体。线粒体自噬对这种发育调节性线粒体降解至关重要[10]。这个过程开始于一个主要来自内质网，线粒体和高尔基体的特殊膜的延伸，称为吞噬泡。吞噬泡围绕需被消除的分子和细胞器，当两个膜端连接时，形成称为自噬体的囊泡。这种细胞器与胞内结构相互作用，产生一种前溶酶体杂交细胞器，称为amphisome。最后，amphisome与溶酶体融合，导致酶蛋白水解,使被隔离的物质降解[11]。

2 自噬相关信号调控

自噬以自噬小体形成为核心，受Atg基因以及多种信号途径传导的调控。对酵母和哺乳动物的研究已经发现至少有40个Atg基因，其编码的蛋白质参与自噬[12-13]。自噬诱导阶段哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)参与调控。mTOR可以感受生长因子信号转导、细胞能量状态和应激反应。正常状况下，mTOR可以抑制细胞自噬的活化。当出现饥饿、营养匮乏以及压力刺激等状态时，mTOR则通过mTOR/Atg1/Atg13信号通路以及mTOR/ULK1/Atg13信号通路影响自噬[14]。典型的自噬涉及外源性或内源性刺激使线粒体去极化同时产生活性氧(ROS)。进而通过活化AMP激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路，抑制mTOR。这一过程激活典型的自噬蛋白如ULK1和Beclin-1，导致膜的成型和吞噬泡形成。ULK和Beclin1-PI3KC3复合物是自噬体形成所需的关键信号转导复合物。mTORC1和AMPK直接向ULK复合物发出信号并影响其活动。不同Beclin1-PI3KC3复合物的形成和活化产生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)，这是募集自噬效应物所需的信号传导脂质。另一方面，在涉及Atg7和Atg5等的酶促过程中，通过磷脂酰乙醇胺脂化形成LC3-II使自噬相关蛋白LC3的构象变化，实现LC3的活化。而LC3-II锚定在吞噬泡膜上。去极化或受损的线粒体将蛋白暴露在其表面具有能与LC3相互作用的区域(LIR)。这使得当自噬体完全形成时，LC3和吞噬泡相互作用，围住并吞噬受损细胞器。带有吞噬物的自噬体继续其成熟过程，最终与溶酶体融合降解内含物[11,9]。

3 自噬与凋亡

自噬和凋亡之间也有千丝万缕的关系。自噬与凋亡之间调控原件的相互作用证明这两个过程交叉的复杂性，例如Bcl-2与Beclin-1的相互作用，LC3B与Fas的相互作用等[15]。虽然没有证明过度自噬与自噬抑制直接引起细胞死亡，但也有学者认为两者可能都与凋亡相关[16]。有报道认为，自噬是凋亡发生所必需的，通常发生在凋亡之前，进而启动凋亡。自噬的发生也可以抑制凋亡，进而保护细胞。细胞自噬可以通过自噬相关蛋白降解促凋亡蛋白，如Caspase、B cell lymphoma2(Bcl-2)家族蛋白等，起到抑制细胞凋亡的作用。自噬与凋亡之间可以发生转化，一些环境中，当凋亡被抑制时，细胞就会向自噬转化[17]。

4 自噬与MDS

4.1 MDS的自噬异常现象

自噬在肿瘤细胞中通常处于异常或失调状态[18]。MDS为血液系统恶性肿瘤性疾病，也发现存在自噬失常。异质性较高的MDS中，患者的自然病程和预后的差异性很大，自噬在不同亚型MDS中，其失衡的不同状况值得关注。目前国内外研究主要结合IPSS、WPSS预后分组系统将MDS分为两组：相对低危组(IPSS-低危组、中危-1组，IPSS-R-极低危组、低危组和中危组，WPSS-极低危组、低危组和中危组)和相对高危组(IPSS-中危-2组、高危组，IPSS-R-中危组、高危组和极高危组，WPSS-高危组和极高危组)。结果低危组MDS患者外周血血小板的减少是由于骨髓巨核细胞中存在过度自噬等细胞程序性死亡造成的[19]。与正常健康人对照，低危组MDS红系集落中可见早期红系分化中存在过度自噬现象[20]。动物实验也证实了相同的观点，条件性敲除小鼠造血干细胞必要的自噬基因Atg7，当大量Atg7-/-红细胞积累导线粒体膜电位的改变和细胞死亡[21]，则小鼠发展成贫血，表现类似MDS。

另一方面，有研究提示相对高危组MDS患者自噬水平明显减低，有核红细胞自噬水平随危险度的升高而降低[22]。也有非直接的证据表明，自噬与急性髓细胞白血病发病有关，在AML患者中可见PI3K/AKT/mTOR信号通路活化异常[23]。在白血病细胞中，自噬可能是有害的，可能导致细胞凋亡率增加或者对癌细胞的增殖和存活起到保护作用[10]。MDS发展向白血病转化过程中也可能存在自噬异常，但上述报道较少，是国内外研究的薄弱环节。

4.2 自噬失调为MDS发生及进展病理机制之一

自噬失调存在于MDS中的证据越来越明确。MDS发病与细胞分化异常，基因组不稳定等相关[24]，进而引起造血细胞稳态失常。而细胞自噬正是维持体内细胞稳态的重要机制，同时参与红系、血小板等多系造血细胞分化[25]。机体正常的细胞都具有自噬能力，这一能力可以为细胞清除化学致癌物以及因射线、氧化应激而受损的细胞器(主要是线粒体)，从而使细胞DNA避免因活性氧物质(ROS)而造成损伤，保证了遗传稳定性，降低了细胞恶变的发生率。所以自噬在维持基因组稳定性方面发挥着重要的作用[26]。研究表明，自噬基因Atg7缺乏的小鼠其造血干细胞(HSCs)自我修复能力受损，MDS患者中可见自噬缺乏的造血干/祖细胞线粒体受损、并与ROS增高及细胞增殖与凋亡水平的增加相一致[3]。同时自噬与MDS免疫稳态也密切相关，自噬对T细胞阳性、阴性选择、B1a细胞发展、记忆性B细胞及浆细胞的维护保持、IgG分泌平衡等发挥着重要的作用。若自噬缺乏则会导致免疫稳态失衡，细胞对各种压力更加敏感，最终导致如MDS等恶性血液肿瘤疾病的发生[27]。

4.3 MDS治疗与自噬调节

实体肿瘤疾病中，自噬已被证明可以抑制肿瘤发展，并可以激活细胞程序性死亡。但另一方面由于自噬可以为癌细胞提供能量，当细胞处于营养匮乏、ATP及氧化应激等不利条件时，则激活自噬，将促进肿瘤增殖[28]。自噬在MDS发病发展过程中是把“双刃剑”,具有双向调节的作用。因此，调节自噬失调成为MDS治疗的热点之一[25]。有研究表明，mTOR抑制剂替西罗莫司治疗2周SF3B1+/-小鼠表现出血红蛋白的提升[29]。自噬抑制剂氯喹(chloroquine CQ)也被报道可以提高阿扎胞苷(5-azacytidine)细胞毒作用，提高治疗疗效，为阿扎胞苷治疗后病情仍进展的MDS患者提供了全新的治疗方法[30]。

5 中医药治疗MDS的自噬调节研究

5.1 自噬的中医内涵

自噬是真核细胞特有的保护机制，其主要作用在于维持细胞稳定性，提高细胞对外界如饥饿、压力等应激状况下的适应能力，清除异常代谢的成分，以对抗外界不利因素，其双向调节保持生理平衡的功能，与中医扶正祛邪理论实质紧密相关。石冬燕等[31]认为，自噬与中医卫气密切相关。邪气入侵机体后正气奋起抗邪，祛邪外出与自噬清除“垃圾”产物并保护受损细胞的机制某种程度极其一致。王玉等[32]则认为，自噬的发生与中医痰瘀机制存在相似之处。细胞内有害物质的形成是中医“痰瘀”形成的微观原因，细胞自噬对有害物质进行降解和清除过程则是中医“炼精化气”的微观体现。

中医理论认为，气具有推动，温煦、防御、固摄、营养、气化等功能。细胞自噬与上述功能密切相关。通过调节自噬功能，推动、促进、激发人体的生长发育及维持脏腑经络等器官的生理功能；当自噬功能减退时，气的推动功能减弱，可出现病理产物堆积过多，衰老、机体运行迟缓等异常。气之温煦作用通过促进机体新陈代谢来实现，自噬正是机体细胞新陈代谢的主要方式之一。气的固摄作用通过气对血、津液等物质的稳定来实现，自噬的主要功能即是维持稳态。气的营养作用表现为细胞自噬通过自身净化、转化，自我营养的过程。气化泛指内外环境、人体物质基础的互相转化，也提示了细胞自噬作用传化的特点。因此笔者认为，细胞自噬功能与中医正气功能的实质内涵相关，符合“气有胜复，胜复之作，有德有化，有用有变”的特征。而“痰”“湿”“瘀”“毒”则是微观自噬功能失调，宏观呈现正气不足，内生实邪的病理表现。

5.2 中医药调节自噬研究进展及调节自噬治疗MDS的可行性

古籍中医文献并无骨髓增生异常综合征病名，根据患者的临床表现，可将MDS归属于“虚劳”“血证”“内伤发热”等证范畴。目前临床骨髓增生异常综合征通常对应的中医病名为“髓毒劳”，其含义为：“髓”代表病位，“毒”代表病性,“劳”代表病状[33]。虽然中医临床各家对MDS病因病机各有不同表述，莫衷一是，但均认可其病性为正虚邪实，两者并存。但随着MDS疾病发展，正消邪长，先是表现出正虚为主、邪实为辅，继而正邪抗衡，直至转变为邪实为主、正虚为辅等正邪虚实偏重不同[34]。中药治疗MDS则常结合分期分型实施辨证论治。MDS低危期主要以扶正为主兼以清解邪毒；而高危期则重用解毒化瘀，佐以健脾补肾，益气养阴之品[35]。

MDS的正邪转化与自噬失调密切相关，因此，对MDS具有良好作用的中医药干预自噬失常研究及应用拥有广阔前景。近年越来越多的研究表明，治疗MDS使用频次较高的健脾补肾、益气养阴、解毒化瘀类中药对自噬具有良好的调节作用。如具有扶正之功的党参、白术、莪术、半夏等组成的中药颗粒，体内研究显示，每天1次维持25天可显著减少肿瘤体积约50%，可以诱导SGC-7901细胞自噬的模式，包括细胞内空泡形成，微管相关蛋白1轻链3(LC3)转换。Hoechst 33258染色和凋亡相关蛋白的Western印迹分析显示其诱导的SGC-7901细胞死亡不是通过细胞凋亡，而是通过自噬作用诱导胃癌细胞死亡[36]。以全蝎、蜈蚣、地龙、陈皮、半夏、白术、水蛭为主方的搜风祛痰中药复方可以增加自噬相关蛋白Beclin-1和LC3蛋白的表达，提高自噬作用保护细胞抵御各种应激，防止细胞发生凋亡及坏死[37]。靛玉红衍生物(E804)作为中药靛玉红的一种有效成分可抑制肿瘤细胞活性，促进自噬标记物LC3-B及Beclin-1的表达上升，且呈明显的剂量依赖效应。其作用机制涉及通过抑制Stat3 (signal transducerand activator oftranscription 3) 活化促进胃癌细胞自噬活动来抑制胃癌细胞生长[38]。人参皂苷Rh2(Rh2)能通过激活MAPK、ATK、EKR信号通路，诱导细胞自噬途径，从而抑制人白血病细胞KG1α细胞增殖和促进其凋亡[39]。青蒿琥酯(artesunate，ART)是从黄花蒿茎叶中提取的有效成分。研究表明ART以时间剂量依赖性方式抑制白血病K562细胞自噬，可能通过抑制自噬体的融合降解、下调自噬形成相关分子HMGB1、Beclin-1的表达而减弱肿瘤细胞对恶劣肿瘤微环境的应激反应，扩大肿瘤细胞的损伤，最终促进K562细胞的死亡[40]。综上，现有研究揭示中药可参与自噬调节，自噬稳态的调控而发挥治疗作用，这可能与其正气充养调节，痰、瘀、毒等病理产物的清除有关。因此通过干预纠正自噬异常也可能是中药治疗MDS一条有效途径。

6 结语

现代医学揭示,MDS的发生和发展是多步骤，多环节的渐进过程，细胞自噬途径可能参与MDS发生发展，并且在不同阶段及病情状态下，自噬失衡存在动态变化，造成MDS外周血细胞不同程度的减少，产生贫血、感染、出血等临床症状，甚至自噬失衡参与骨髓增生异常综合征向白血病传化的病理机制。中医药研究发现,MDS具有“本虚标实、正消邪长”的病证特性，中医药辨证治疗MDS显现临床疗效，同时不少临床常用治疗MDS有效中药复方、单药及中药成分对自噬存在调节作用，这些为临床的治疗选择提供了新的思路及研究方向。但细胞自噬异常与MDS疾病发生发展的深入研究报道至今仍然较少，自噬在各类型MDS中的具体表现、失衡机制及亚组间比较分析的相关报道也较少，细胞转导途径及细胞自噬起源仍不十分清楚。尤其2016年WHO根据形态学、免疫学、遗传学等对MDS进行了新的分型[1]，精准医疗及分层治疗在MDS治疗策略中日益受到重视，这些都值得我们深入研究。与此同时，中医药对于自噬干预的研究虽有报道，但针对MDS不同分期分型所呈现的不同自噬失常状态，实施中药或中药复方精准干预的研究仍为空白，值得引起关注。期望尽快开展相关研究，为临床中医药治疗MDS提供新的有效方案和明确的作用机制。