大黄和水蛭含药血清药物化学实验研究

高旭光， 翟文生， 杨濛， 马静， 宋纯东， 李广

大黄、水蛭的经典配伍应用见抵当汤和抵当丸，出自东汉张仲景《伤寒杂病论》，主治太阳蓄血、阳明蓄血证，具有活血通络逐瘀之效。本科常用大黄和水蛭配伍治疗IgA肾病和紫癜性肾炎可明显减轻血尿和蛋白尿，改善肾病患儿的预后[1-2]。用药后大黄和水蛭有效成分能否入血，目前尚缺乏相关的血清药物实验研究，2015年版《中国药典》以大黄素、大黄酚为指标对大黄进行质量控制[3]，次黄嘌呤为水蛭中所含的有效成分之一[4-5]。故我们采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatographic，HPLC)检测大黄组和水蛭组大鼠血清的有效成分大黄酸和大黄素、次黄嘌呤，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠36只，1.5～2月龄，体质量(200±20)g，由郑州大学动物实验中心提供[合格证编号：SCXK(豫)2010-0002]。

1.2 实验药品 水蛭颗粒、大黄颗粒(江阴天江药业有限公司)；生理盐水(四平巨能药业有限公司)；10%水合氯醛。以上药物均购于河南中医学院第一附属医院药房。

1.3 主要试剂 大黄酸(110757-201009，纯度>98%)，大黄素(110756-201010，纯度>98%)，次黄嘌呤(140661-201006，纯度>99.6%)，均购自中国药品生物制品检定所；色谱纯：甲醇、乙腈；实验用水：纯净水，由河南中医学院第一附属医院中心实验室提供。

1.4 主要仪器 超高效液相色谱仪：Waters Acquity H-class；TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)；QL-901混匀仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；BF-2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；电子天平：Sartorius-CP225D(1/10万)(德国赛多利斯)。

1.5 实验方法

1.5.1 含药血清的制备 36只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、大黄组和水蛭组各12只。参照临床成人用药剂量估算为实验动物用药剂量，给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度[6]。查表得70 kg人与200 g大鼠的等效面积系数为0.018，选用水蛭3 g，大黄10 g。根据大鼠灌胃常用量10～20 mL/kg及药物的最大可溶解度，在本实验中选用的等容灌胃量为20 mL/kg。将水蛭、大黄颗粒剂制成混悬液：大黄颗粒制成0.25 g生药/mL，水蛭颗粒剂制成浓度0.08 g生药/mL。对照组同法灌胃等容积生理盐水。

在预实验的基础上，连续灌胃10 d，在灌服最后1剂后2 h，经腹主动脉取血，静置2 h，3 000 r/min离心10 min后取上层血清，0.22 μm过滤除菌，分装，-70 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 对照组血清供试品的制备 取对照组血清0.3 mL，加甲醇乙腈(3∶1)1.1 mL，涡旋1 min，15 000 rpm离心15 min，吸上清液，用0.22 μm滤膜过滤，取0.7 mL滤液，于40 ℃氮气流下吹干，残留物用100 μL流动相溶解，涡旋1 min，15 000 rpm离心10 min，吸上清液，按上述方法测定。

1.5.3 大黄颗粒血清中大黄酸、大黄素的检测

1.5.3.1 血清样品的处理取 大黄颗粒血清样品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制备步骤同对照组血清供试品的制备。

1.5.3.2 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：0.6 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.5.3.3 大黄素、大黄酸对照品的制备 取大黄素、大黄酸适量，精密称定，分别为0.51 mg、0.74 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

1.5.4 水蛭颗粒血清中次黄嘌呤的检测

1.5.4.1 血清样品的处理 取水蛭颗粒血清样品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制备步骤同对照组血清供试品的制备。

1.5.4.2 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-水(10∶90)；流速：0.3 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：0.5 μL。

1.5.4.3 次黄嘌呤对照品的制备 取次黄嘌呤适量，精密称定为1.91 mg，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇(50%)定容至刻度，即得。

2 结果

2.1 大黄颗粒血清中大黄酸、大黄素的检测结果 血清对大黄酸的检出有一定的干扰，大黄颗粒血清供试品未检出大黄酸；但对大黄素检出无干扰，血清中可以检测到大黄素。分别见图1～4(见封三)。

2.2 水蛭颗粒血清中次黄嘌呤的检测结果 血清对次黄嘌呤的检出无干扰，大鼠血清中次黄嘌呤色谱峰较高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭颗粒给药后大鼠自身产生的成分。分别见图5～7(见封三)。

3 讨论

肾脏疾病发病率不断升高，已经成为一种公共卫生问题[7]。IgA肾病和紫癜性肾炎是小儿肾脏病中常见的类型，都需要长期治疗，两者均为肾小球系膜区或伴有毛细血管襻以IgA为主的免疫球蛋白沉积或仅有IgA沉积，肾小球系膜细胞增生及细胞外基质积聚，导致肾小球肾炎，是肾脏病进展的主要病理过程[8-10]，有效阻止系膜细胞增生及细胞外基质积聚，防止肾小球肾炎发展，目前尚无理想治疗方法。

从临床表现和疾病进程分析，IgA肾病和紫癜性肾炎应归属祖国医学中“尿血”“腰痛”“水肿”“虚劳”“关格”等范畴。肾病患儿病机为本虚标实，血瘀证是最重要的标实证，瘀血为疾病本身的病理产物，也是贯穿肾病始终的病理因素，瘀血不散，血不归经，进一步损伤脉络，而造成肾病蛋白尿、血尿反复不愈，故瘀血阻滞是导致本病反复发作或久治不愈的关键因素之一。《素问·调经论》云:“瘀血不去，其水乃成”，“孙络水溢则经有留血”。《金匮要略》提及“血不利则为水，名曰血分”提示脉道血液运行障碍发为水证，易致水肿。唐宗海在《血证论》指出“血与水素本不相离，病血者未尝不病水，病水者未尝不病血”，“瘀血化水，亦发水肿，血积即久，亦能化为痰水”，明确提出肾病与瘀血存在密切联系，血凝则水停，水泛致血瘀。现代医学的发展，近代医家更加重视对肾病血瘀证的研究，丰富了中医肾病血瘀证的理论。肾脏病瘀血形成机制很多，就IgA肾病和紫癜性肾炎而言其瘀血的来源主要有四：其一，来源于出血。大部分该病患者均表现为不同部位的出血，出血必留瘀，瘀血阻络，妨碍气血运行，新血不能归经而外溢肌肤，形成紫斑，即所谓离经之血便为瘀血。其二，来源于热邪。热邪为肾炎的启动病因，热邪炽盛迫血妄行，血不循经而为瘀。其三，来源于湿邪。湿邪有形，阻碍气机，气滞血瘀。其四，来源于脏腑气机紊乱。病程日久，或气虚或气滞或有形之邪阻滞，血运失常而成瘀。大黄和水蛭配伍应用是我们20余年的临床经验，临床中发现大黄和水蛭配伍可以改善IgA肾病和紫癜性肾炎的血瘀状态，减少血尿和蛋白尿，灌药后血清中是否含有大黄和水蛭的主要成分。我们采用HPLC检测大黄、水蛭灌胃的大鼠血清中的大黄酸、大黄素和次黄嘌呤，为临床用药提供理论依据。

检测结果显示，大黄组大鼠血清含有大黄素，虽然血清对大黄酸的检出有一定的干扰，未在血清样品中检出大黄酸，其原因可能有两个：一是血清本身对大黄酸有一定的影响，二是大黄酸可能入血后含量太低以至于低于检测限而未能检出。但血清供试品中大黄素检测存在，亦能说明大黄主要成分可以进入大鼠血清；水蛭组在大鼠血清中次黄嘌呤色谱峰较高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭颗粒给药后大鼠自身产生的成分，说明大鼠给药后血清中含有水蛭主要成分次黄嘌呤，可以产生药效作用。经高效液相色谱法测定，证实了实验中的大鼠含药血清含有大黄和水蛭的主要成分。