响应面法优化超声提取牡丹籽壳低聚茋类化合物的工艺研究

刘丹丹，郑旭煦,，殷钟意，衡银雪(.重庆工商大学 环境与资源学院，重庆400067； .重庆工商大学 催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆400067)

牡丹属于芍药科芍药属多年生落叶小灌木，牡丹籽可榨油，牡丹籽油于2011年3月被卫生部列入新资源食品。随着牡丹籽油的开发利用，其加工副产物牡丹籽壳常常被直接丢弃，不仅增加固体废弃物负荷，还造成资源的浪费。已有学者对牡丹籽壳的成分进行研究，其中含有低聚茋类化合物。低聚茋类化合物是一种由1,2-二苯乙烯为单体聚合而成的化合物，结构独特且复杂，具有抗氧化[1]、抗癌[2-4]、保肝[5-6]、抗病毒[7-9]、降血糖[10-11]、降血脂[12-13]等生物活性。目前，对牡丹籽壳中低聚茋类化合物的研究较少，对其生物活性了解不多，故本研究采用超声波辅助甲醇提取工艺对牡丹籽壳中的低聚茋类化合物进行提取，并优化提取工艺，为牡丹籽壳的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

牡丹籽：60℃烘干至恒重，含水率低于5%，机械脱壳后将牡丹籽仁及牡丹籽壳分离，牡丹籽壳粉碎后过40目筛，避光保存于干燥罐中。

没食子酸标准品：国家标准物质中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DFY-1000摇摆式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司；Infinite 200酶标仪：帝肯(上海)贸易有限公司；TDZ4A-WS低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；RE-52A旋转蒸发仪。

1.2 实验方法

1.2.1 低聚茋类化合物的提取

精确称取牡丹籽壳粉末1.000 0 g±0.000 5 g，加入不同液料比、不同体积分数的甲醇，在一定温度下超声提取一定时间，以3 500 r/min离心10 min，取上清液，将上清液减压蒸发挥去甲醇，剩余浸膏60℃烘干，避光保存于干燥罐中。

1.2.2 低聚芪类化合物含量测定

采用Folin-Ciocalteu法[14]，以没食子酸为标准品测定低聚茋类化合物的含量。于750 nm处进行测定，以吸光值为y轴，标准品质量浓度为x轴绘制标准曲线，回归方程为y=0.122 76x+0.001 92(R2=0.999 3)。提取物中低聚茋类化合物的含量以没食子酸当量表示。

1.2.3 DPPH自由基清除能力测定

用50%乙醇配制不同质量浓度的提取物，用移液枪吸取100 μL与100 μL 0.04 mg/mL DPPH溶液加入96孔板，摇匀后室温避光放置20 min后在波长517 nm处测定吸光值(A1)，取100 μL 0.04 mg/mL DPPH溶液和100 μL 50%乙醇混合，同样方法测定吸光值(A0)，再取100 μL无水乙醇与100 μL不同质量浓度提取物溶液混合，相同方法测定吸光值(A2)[15-16]。低聚芪类化合物对DPPH自由基的清除率为：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.2.4 亚铁离子还原能力(FRAP)测定

绘制硫酸亚铁标准曲线：取2.78 g硫酸亚铁以水定溶于100 mL容量瓶，加入小铁钉。将溶液稀释到0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L，各取20 μL置于96孔板，并加入180 μL预热到37℃的FRAP工作液，混匀后于波长593 nm处测定吸光值[17]，以亚铁离子浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到的回归方程为：A=1.138 6C-0.011(R2=0.991 9)。

分别取不同质量浓度的样品溶液20 μL置于96孔板，并加入180 μL预热到37℃的FRAP工作液，每个质量浓度做3个平行组，混匀后于波长593 nm 处测定吸光值并取平均值。根据吸光值在标准曲线上找到与之对应的亚铁离子浓度，以样品质量浓度为横坐标，以亚铁离子浓度为纵坐标作图，用亚铁离子浓度衡量样品活性，数值越大则样品抗氧化活性越好。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比的影响

固定甲醇体积分数70%、提取温度50℃、提取时间30 min，在液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1条件下分别对原料进行提取，考察液料比对得率的影响，做3组平行实验。结果见图1。

图1 液料比对低聚茋类化合物得率的影响

由图1可知，低聚茋类化合物得率在13.35%～14.65%之间变动，液料比10∶1时得率最低，之后开始增加，20∶1～50∶1之间变动不大，波动在0.2%以内，低液料比会导致提取物不能完全溶解于溶剂中，随着液料比的增加提取物可以完全溶解。因此，在保证提取效率同时考虑到节约溶剂问题，液料比选择20∶1。

2.1.2 提取时间的影响

固定液料比20∶1、提取温度50℃、甲醇体积分数70%，将提取时间定为10、20、30、40、50 min，考察提取时间对得率的影响，做3组平行试验。结果见图2。

由图2可知，随着提取时间的延长，低聚茋类化合物得率先增加，在40 min处达到峰值(15.67%)，之后开始下降。这是因为提取物的浸出需要一定的时间，若提取时间过短则会造成浸出不完全而得率低，随提取时间延长提取物不断浸出所以得率升高，但是超声波具有空化作用，提取时间过长会对提取物的结构造成破坏。因此，提取时间选择40 min。

图2 提取时间对低聚茋类化合物得率的影响

2.1.3 提取温度的影响

固定液料比20∶1、提取时间40 min、甲醇体积分数70%，将提取温度设定为30、40、50、60、70℃，考察不同提取温度对得率的影响，做3组平行实验。结果见图3。

图3 提取温度对低聚茋类化合物得率的影响

由图3可知，牡丹籽壳中低聚茋类化合物得率随着提取温度的升高呈现从8.9%开始上升后在60℃达到最高(17.1%)之后下降的趋势，这是因为温度会对提取物的溶出速度造成影响，温度升高有利于提取物的溶出，但温度过高会破坏提取物的结构。因此，提取温度选择60℃。

2.1.4 甲醇体积分数的影响

固定液料比20∶1、提取时间40 min、提取温度60℃，考察不同甲醇体积分数对得率的影响，体积分数从50%～90%平均设定5个水平，做3组平行实验。结果见图4。

图4 甲醇体积分数对低聚茋类化合物得率的影响

由图4可知，低聚茋类化合物得率随着甲醇体积分数的增大呈现先升高后降低的趋势，在15.7%～17.4%之间变化，在甲醇体积分数为70%时达到峰值，因为不同体积分数的甲醇具有不同的极性，牡丹籽壳中的低聚茋类化合物的极性与70%甲醇最为接近。因此，甲醇体积分数选择70%。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 Box-Behnken实验设计与结果

在单因素实验基础上，选取液料比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、甲醇体积分数(D)为考察因素，以低聚茋类化合物得率(Y)为考察指标，按照Box-Behnken原理，设计四因素三水平响应面实验。响应面因素水平见表1，响应面实验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 响应面因素水平

表2 响应面实验设计及结果

表3 方差分析

结合单因素实验结果，采用Design-Expert 8.0对响应面实验进行设计，并对实验结果进行拟合，得到牡丹籽壳低聚茋类化合物得率方程为：

Y=17.54+0.97A-0.035B+0.21C-0.22D+0.28AB+0.25AC-0.43AD+0.47BD-1.19A2-1.38B2-0.51C2-1.46D2-0.21A2C+1.02A2D-0.84AB2+0.57B2D-1.41A2C2

由表3可以看出，拟合模型极显著(P<0.000 1)，R2为0.987 0，校正后的R2为0.967 0，F值为 49.24，都表明模型合理。C、AB是显著因素，A、AD、BD、A2、B2、C2、D2、A2D、AB2、B2D、A2C2是极显著因素，失拟项的F值为4.21，表明失拟项都是由误差造成，失拟项不显著(P=0.091 5)。由F值可看出，4个因素对低聚茋类化合物得率的影响顺序为A>C>D>B，即液料比>提取温度>甲醇体积分数> 提取时间。模型信噪比为 26.819 大于4，模型可用于拟合实验结果。

2.2.2 优化与验证实验

利用Design-Expert 8.0软件进行预测，得到最优工艺条件为：液料比21.9∶1，提取时间40 min，提取温度62℃，甲醇体积分数70.5%，预测得率为17.76%。对此预测结果进行验证，验证的实验条件为：液料比22∶1，提取时间40 min，提取温度62℃，甲醇体积分数70%，平行测定3次，所得结果平均值为17.68%，与预测结果基本吻合，说明经过响应面优化得到的提取条件可靠，具有实用价值。

2.3 DPPH自由基清除率(见图5)

图5 样品与维生素C的DPPH自由基清除率

由图5可知，维生素C与牡丹籽壳低聚茋类化合物都有一定的DPPH自由基清除效果，且呈现出一定的量效关系，即随样品质量浓度增高，DPPH自由基清除效果增强。牡丹籽壳低聚茋类化合物对DPPH自由基的清除效果在低于100 μg/mL时比维生素C强，高于100 μg/mL时，维生素C的DPPH自由基清除率更高。

2.4 亚铁离子还原能力(见图6)

图6 样品与维生素C的亚铁离子还原能力

由图6可知，牡丹籽壳低聚茋类化合物与维生素C的亚铁离子还原能力都与质量浓度呈现一定的量效关系，随质量浓度增加其还原能力增加，牡丹籽壳低聚茋类化合物的亚铁离子还原能力不如维生素C强，质量浓度低时相差不大，质量浓度越高相差越大。

由于测定亚铁离子还原能力时，需要在酸性条件下进行，而低聚茋类化合物都带有酚羟基，在酸性条件下容易反应导致变性，所以与维生素C对照，低聚茋类化合物对亚铁离子还原能力要比对DPPH自由基清除能力低。

3 结 论

采用单因素实验和响应面实验对牡丹籽壳低聚茋类化合物的提取工艺进行优化，得到最佳的工艺条件为：液料比22∶1，提取时间40 min，提取温度62℃，甲醇体积分数70%。在最佳条件下，牡丹籽壳低聚茋类化合物得率为17.68%。

油用牡丹籽壳中的低聚茋类化合物具有一定的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率与维生素C相当，亚铁离子还原能力低于维生素C。

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