miR-29b在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织中表达的研究
2018-01-19王亮杨东霞杨成通讯作者
王亮 杨东霞 杨成(通讯作者)
(滨州医学院 山东 烟台 264003)
1.材料和方法
健康清洁级雄性Wistar大鼠27只,在标准条件下饲养。根据随机分组原则把27只大鼠分为正常对照组(C组,9只)、生理盐水组(N组,9只)和博莱霉素致肺纤维化组(B组,9只)。气管给药,B组按照5mg/kg体重的量注入博莱霉素,N组换成等量生理盐水,注入后立即直立旋转动物,使药液在两侧肺内分布均匀,缝合颈部皮肤切口。每组动物于7、14、28d用腹主动脉放血法分别处死3只。麻醉后处死,气道灌注进行左肺内固定半个小时,行10%福尔马林固定。行切取组织过程,经H-E和Massom染色切片观察病理变化。肺泡炎、肺纤维化程度根据Szapiel[1]等的方法分级。行miR-29b的qRT-PCR检测:(1)各组肺组织总RNA提取。(2)逆转录反应:准备PCR反应体系25µl,取5µl总RNA。(3)各组取5µl行PCR扩增,U6 RNA做内参。从PCR仪读取Ct值后,各样本重复检测3次,取Ct均值,以C组与U6的差作为△Ct;△△Ct表示B组减去△Ct均值的差。做统计分析,以2-△△Ct计算表达量。
数据应用SPSS for windows 13.0统计分析软件在计算机上进行,进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
肉眼观察C组双肺呈淡粉色,表面光滑,弹性良好。B组双肺体积缩小,颜色暗红,表面凹凸不平不平,可见小片状的苍白灶,质地较硬,弹性差。HE染色镜下观察:N组大鼠肺组织无明显病理变化发生(图1A)。B组7d出现中度至中度肺泡炎的改变,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔内炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润明显增多,成纤维细胞开始增生;14-28d肺组织炎症反应逐渐减轻,成纤维细胞增生越来越严重,纤维组织明显增生,肺实质结构破坏萎缩,肺泡腔消失。博莱霉素致肺纤维化模型建立成功。(图1B)。
图1A C组大鼠肺组织 HE染色×200
图1B B组大鼠肺组织(14~28d) HE染色 ×200
B组的肺泡炎评分比C组与N组高,差别有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表1。
表1 各组肺组织肺泡炎评分(±s)
表1 各组肺组织肺泡炎评分(±s)
注:*与C组相比,P<0.05;#与N组相比,P<0.05。
组别 第7天 第14天 第28天C组 0.1±0.5 0 0 N组 0 0 0 BLM 组 2.2±0.6*# 1.6±0.4*# 1.4±0.7*#
masson镜下观察N组大鼠肺组织无纤维化改变发生(图2)。B组7d成纤维细胞开始增生,14~28d,逐渐增多,28d肺实质结构完全破坏,大量纤维组织增生。(图3)
图2 C组大鼠肺组织 MASSON染色 ×200
图3 B组大鼠肺组织 MASSON染色 ×200
N组与C组均比B组的评分低,差异有显著性意义(P<0.05)。具体结果见表2。
表2 各组肺组织纤维化评分(±s)
表2 各组肺组织纤维化评分(±s)
注:*与C组相比,P<0.05;#与N组相比,P<0.05。
组别 第7天 第14天 第28天C组 0 0 0 N组 0. 0 0 B 组 0.4±0.5*# 1.4±0.6*# 2.1±0.5*#
各组不同时间点肺组织miR-29b的表达
3.讨论
miR-29b是miR-29中主要成员,近年来miR-29b成为诊疗纤维化疾病的研究热点。目前,已有人通过研究证实,在肝胶原合成增加过程中有miRNA-29b的参与并且表现负性表达,病程的发展速度在miR-29b的作用下呈现下降趋势,这些现象都能够证明miR-29b在对抗纤维化的过程中有着重要的作用[2]。
本实验表明,B组7d后病理学观察大鼠的肺组织呈急性炎症改变,无明显纤维增生改变;B组14d和28d后镜下观察大鼠的肺组织与C组相比均发生纤维组织增生改变。镜下观察细支气管及以下管道的大量胶原纤维化出现、肺泡间隔增宽,炎症逐渐减轻,肺泡逐渐萎缩,泡腔内发生淋巴细胞浸润,尤以近胸膜处病变较为严重。28d较其他组肺纤维化明显加重,说明随着时间的延长,博莱霉素致肺纤维化的作用越明显。利用qRT-PCR检测miR-29b,B组肺组织miR-29b表达在第14及28d均比C组、N组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。说明随着纤维化病变程度加重,miRNA-29b表达降低。miRNA-29b表达在形成纤维化的病程中的变化,其详细的作用机理还没被完全阐述,推测miR-29b的变化方式可能与肺纤维化初期组织损伤后修复有关联。
综上,本实验提示肺纤维化模型中miR-29b参与肺纤维化的发生发展。其有望作为一个新型的防治肺纤维化的指标。
[1]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al .Bleomycininduced interstitial pulmonary diseases in the nude,athymicmouse[J].AmRev Respir Dis,1979,120(4):893-899.
[2]俞富军,郑建建,高申孟,等.miR-29b抗肝纤维化的机制研究.中国卫生检验杂志[J].2013,2(23):268-271.